Este es un trabajo de investigación fantástico y de excelente calidad.
Los ratones humanizados tienen limitaciones en términos de modelado de la inmunidad humana, particularmente en lo que respecta a las respuestas de anticuerpos. Chupp, et al. (A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses. Nat Immunol (2024). https://doi.org/10.1038/s41590-024-01880-3 ) reportan que construyeron un ratón humanizado (THX) mediante el injerto de crías inmunodeficientes KitW-41J mutantes mieloabladas genéticamente y no irradiadas co γ con células CD34+ de sangre del cordón umbilical humano, seguido de un acondicionamiento con 17β-estradiol para promover la diferenciación de las células inmunitarias. Los ratones THX reconstituyen un sistema inmunológico linfoide y mieloide humano, incluidas las células B de la zona marginal, las células B del centro germinal, las células T auxiliares foliculares y los neutrófilos, y desarrollan ganglios linfáticos y tejido linfoide intestinal bien formados, incluidas las placas de Peyer y células epiteliales del timo humano. Estos ratones tienen diversos repertorios de receptores de antígenos de células B y células T humanas y pueden generar respuestas de anticuerpos maduras dependientes e independientes de las células T, lo que implica hipermutación somática, recombinación de cambio de clase y diferenciación de células plasmáticas y células B de memoria. Tras la vacunación con flagelina o una vacuna de mRNA de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) de Pfizer-BioNTech, los ratones THX generan respuestas de anticuerpos neutralizantes contra Salmonella o el dominio de unión al receptor Spike S1 del virus SARSCoV-2 con incremento sanguíneo de citoquinas humanas, incluido APRIL, BAFF, TGF-β, IL-4 e IFN-γ, todos a niveles fisiológicos. Estos ratones también pueden desarrollar autoinmunidad lúpica después de la inyección de pristano. Al aprovechar la actividad de los estrógenos para respaldar la diferenciación de las células inmunitarias humanas y la maduración de las respuestas de anticuerpos, los ratones THX proporcionan una plataforma para estudiar el sistema inmunológico humano y desarrollar vacunas y terapias humanas.
En Detalle
Muchos de los más de 1.600 genes de respuesta inmune de ratón son incongruentes con sus equivalentes humanos, lo que resulta en divergencias o deficiencias de los ratones como predictores de las respuestas inmunes humanas(1P, lo que hace que la disponibilidad de un modelo de ratón «humanizado» que reproduzca fielmente las respuestas inmunes humanas sea una alta prioridad. Los primeros ratones con sistema inmunológico humanizado se construyeron inyectando linfocitos de sangre periférica humana o células madre hematopoiéticas humanas (CD34+) (huHSC; se utiliza el prefijo hu para humano o humanizado) en ratones Prkdcscid (SCID) con inmunodeficiencia combinada grave o knockout Rag1/Rag2 ( KO) ratones(2,3,4,5,6). Posteriormente, el injerto de huHSC de ratones diabéticos no obesos inmunodeficientes NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz o NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgnull (NSG)(7,8), en los que la eliminación de Il2rg produce una señalización defectuosa de citocinas en múltiples receptores de células inmunitarias, amplió el alcance de la humanización de ratones(8). En ratones huNSG, la variante del receptor SIRPα de células fagocíticas NOD reacciona de forma cruzada con CD47 humano para inducir una señal de «no me comas», limitando así la fagocitosis de células humanas(5,9). Sin embargo, los ratones NSG permiten una accesibilidad deficiente de las huHSC al nicho hematopoiético de la médula ósea (MO)(5,6,7,8), una limitación que sólo se obvia parcialmente mediante la mieloablación en ratones mediante radiación γ, que, sin embargo, aumenta el riesgo de emaciación, infección y mortalidad(5). Además, los ratones huNSG siguen teniendo una respuesta inmunitaria deficiente. Los intentos de hacer que respondan mejor han incluido la inserción transgénica o knock-in de genes de citoquinas, lo que generalmente resulta, sin embargo, en una expresión suprafisiológica anormal de citoquinas(2,3,4,5,6).
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Aunque se han detectado mutaciones de IgG a ovoalbúmina en ratones knock-in huIL6 Rag2-/-Il2rg-/-SIRPαh/m irradiados con γ (RG SKI interleucina (IL)-6)(10), un ratón humanizado capaz de montar respuestas de anticuerpos completamente maduras aún no se ha establecido. La maduración de la respuesta de anticuerpos implica hipermutación somática de células B (SHM), recombinación de ADN con cambio de clase (CSR), diferenciación de células plasmáticas (PC) que producen anticuerpos de alta afinidad y generación de células B de memoria específicas (MBC). El Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas ha enfatizado la necesidad de un modelo de ratón con sistema inmunológico humano novedoso y más avanzado(2), una recomendación que esencialmente ha sido desatendida. La generación de ratones NSG mutantes KitW-41J homocigotos ha producido ratones NSGW41 (NOD.Cg-KitW-41JPrkdcscidIl2rgtm1Wjl/WaskJ) genéticamente mieloablados, que apoyan el injerto de huHSC radiación γ(11, 12). El KitW-41J mutado dificulta el acoplamiento de las (mo)HSC de ratón a las células estromales de la MO y abre un amplio nicho para el acoplamiento de las huHSC mediante la unión del factor de células madre de ratón(11,12), que está activado por el huHSC c-Kit. Los ratones adultos NBSGW y NSGW41 injertados por vía intravenosa con células huCD34+ de sangre del cordón umbilical soportaron una mayor reconstitución de células linfoides y mieloides huCD45+ que los ratones NSG irradiados con γ(5,11,12). Sin embargo, a pesar de su potencial obvio, los ratones NBSGW y NSGW41 no han sido aprovechados para construir un ratón humanizado avanzado que replique fielmente las respuestas inmunes humanas(2,3,4,5,6).
Los autores crearon un ratón humanizado (THX) injertando recién nacidos NBSGW12 y NSGW41 (ref. 11) con células huCD34+ de sangre del cordón umbilical mediante inyección intracardíaca, seguido de acondicionamiento con 17β-estradiol (E2), el estrógeno más potente y fisiológicamente abundante. E2 apoya la diferenciación de HSC(13,14,15), células inmunes linfoides y mieloides, incluidas las células B de la zona marginal (MZ), las células T auxiliares foliculares (TFH), las células B del centro germinal (GC), los MBC y los granulocitos, todos los cuales expresan receptores de estrógenoERαyERβ(13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26). E2 también aumenta la expresión de AID y BLIMP-1 en las células B, lo que permite la diferenciación de SHM/CSR y PC(27,28,29,30). Los ratones THX reconstituyen un sistema inmunológico humano, incluidos los ganglios linfáticos periféricos (LN), las placas de Peyer y las células epiteliales del timo humano (huTEC). Montan respuestas maduras de anticuerpos neutralizantes contra Salmonella (S.) Typhimurium y el dominio de unión al receptor (RBD) Spike S1 del coronavirus 2 (SARS-CoV-2), junto con citoquinas relacionadas con las células B. Finalmente, los ratones THX son susceptibles de desarrollar inmunopatología y autoanticuerpos de lupus sistémico.
Se han construido ratones humanizados utilizando células huCD34+ o PBMC de MO, hígado fetal o sangre de cordón umbilical, siendo la sangre del cordón umbilical una fuente altamente enriquecida de HSC(5). En ratones THX, el injerto de células huCD34+ de sangre de cordón umbilical de ratones KitW-41J mieloablados genéticamente permite el desarrollo multilinaje de células humanas y una tolerancia inmune total. La inyección intracardíaca maximizaría la diseminación de las células huCD34+ a sitios multifocales de la MO, facilitando así la colonización de las células huCD45+ de los órganos linfoides periféricos, como los LN, el tejido linfoide asociado al intestino y las placas de Peyer. En ratones THX, esto es promovido por E2 y contrasta con formaciones linfoides periféricas subdesarrolladas en huNBSGW, JAX NSG huCD34 y otros ratones humanizados(2,3,4,5,6). En estos, el desarrollo de LN sólo podría lograrse mediante la expresión suprafisiológica de linfopoietina transgénica derivada de células del estroma tímico murino(44). Por lo tanto, además del injerto neonatal de ratones inmunodeficientes KitW-41J mediante inyección intracardíaca, el innovador acondicionamiento de estrógenos es fundamental para la creación de ratones THX.
Una limitación importante de los modelos de ratón humanizados es la imposibilidad de generar respuestas de anticuerpos maduros(2,3,4,5,6). El apoyo de E2 a la maduración de la respuesta de anticuerpos es consistente con respuestas de anticuerpos más fuertes a las vacunas virales, como el virus SARS-CoV-2, la influenza y el virus de la hepatitis B, o vacunas bacterianas, como la difteria, el tétanos y el neumococo, y una mayor incidencia de infecciones mediadas por autoanticuerpos, autoinmunidad en ratones hembra que en machos y en humanos(21,22,45,46,47). En consecuencia, E2 promueve la diferenciación de prácticamente todas las células inmunes, incluidas las células B, las células T y los granulocitos, todos los cuales expresan ERα y ERβ(14,20,21,22,25,26). Aunque se necesita más información sobre el impacto de E2 en la diferenciación de HSC, las HSC CD34+ expresan ERα y ERβ (codificados por los genes Esr1 y Esr2) y se injertan más eficientemente en ratones hembra inmunodeficientes que en ratones macho(13,14,15,24,48).
Los niveles comparables de E2 en sangre en ratones THX machos y hembras fueron más altos que en los ratones huNBSGW, pero dentro del rango fisiológico de E2 de las mujeres. El papel crítico de E2 en la promoción de la diferenciación de células B en ratones THX probablemente refleja una actividad estrógena de células B intrínseca(16,18,49), como lo revela la respuesta de anticuerpos maduros del ratón THX a DNP-CpG independiente de células T. En ratones THX, E2 es fundamental para promover el desarrollo de LN, placas de Peyer y GC, apoyando la diferenciación de huTEC, células huTFH y células B huGC, aumentando la proporción de células B2:B1 y generando huMBC. El acondicionamiento de E2 también fue importante para la aparición de huIgM, huIgD, huIgG y huIgA en BALF y las heces, así como para los altos niveles iniciales de huIgD, huIgG y huIgA en ratones THX inmunizados no intencionalmente. Además, E2 apoyó la diferenciación de las células B huMZ, que aportan anticuerpos que proporcionan la primera línea de defensa contra los patógenos microbianos transmitidos por la sangre. Las células B huMZ del bazo en ratones THX, ya sea inmunizados con NP-CGG, DNP-CpG o flagelina de Salmonella, eran comparables, como proporción de células B, a las células B MZ del bazo en humanos y ratones(50). Al igual que en los humanos, las células B huMZ de los ratones THX se encontraban en una mayor proporción en la sangre circulante que en el bazo.
E2 induce un programa genético, que incluye la expresión de Ptpn6, Bcl2 y Vcam1, que promueve la activación y supervivencia de las células B, al tiempo que amortigua los mediadores proapoptóticos, como PD-1 (ref. 16). El impacto directo de los estrógenos en la diferenciación de las células B se reflejó en la capacidad de las células huB de ratones THX para someterse a CSR, PC y diferenciación de células B similares a la memoria in vitro con tanta eficacia como las células B de humanos sanos, en respuesta a la diferenciación de células B dependientes de células T y estímulos independientes de las células T. De hecho, E2 promueve la expresión de AID de células B y SHM/CSR mediante la regulación positiva de HoxC4, un factor de transcripción que induce al promotor Aicda a activar este gen(27,28,29). E2 también regula negativamente miR-26a, un microARN más abundante en las células B y supresor de la transcripción de Aicda, promoviendo así aún más la expresión de AID(30). Además, los elementos de respuesta al estrógeno se agrupan dentro de las regiones de conmutación (S) de IgH(51), lo que potencialmente permite la amplificación E2 de la CSR. Una vez unido a los elementos de respuesta a los estrógenos, ERα forma complejos con los factores de cotranscripción GATA3 y PBX1 y otros agonistas de la función de las células inmunitarias ERα, incluidos NF-κB, AP-1 y C/EBPβ, lo que conduce a un mayor reclutamiento de RNA polimerasa II(14). Las proporciones altas de estrógeno:andrógeno respaldan la diferenciación de MBC y PC con cambio de clase, como en los ratones macho transgénicos con aromatasa humana(52). Por el contrario, la progesterona (P4), el progestágeno más importante, precursor de la testosterona y potente agonista del receptor nuclear de progesterona, ejerce una actividad negativa sobre la proliferación, diferenciación y expresión de Aicda de las células B, amortiguando así la SHM/CSR(53,54). El impacto de P4 en las células B puede reducir la defensa mediada por anticuerpos y promover enfermedades, como en ratones hembra tratados con P4 infectados con el virus de la influenza(55). Al igual que la P4, la testosterona ejercería un impacto negativo en las actividades de las células inmunitarias, contribuyendo así a respuestas de anticuerpos más débiles a las vacunas bacterianas y virales en hombres que en mujeres(21,22,45,46,47).
Las respuestas de anticuerpos humanos de ratón THX a haptenos conjugados dependientes e independientes de células T, flagelina de Salmonella y péptido viral SARS-CoV-2 Spike S1 RBD, implicaron que SHM/CSR mediara la diversificación intraclonal de clones de células B huIgG+ y huIgA+ expandidos selectivamente, cuyas Los tamaños representaron proporciones importantes de sus respectivos repertorios de células B huIgG+ y huIgA+. Esto contrasta con la, en general, multitud de células B huIgM+ prácticamente sin expansión clonal, posiblemente progenitores de clones de células B huIgG+ y huIgA+ expandidos, con cambio de clase y somáticamente hipermutados. En ratones THX vacunados con mRNACovid o flagelina, el nivel más bajo de huIgA anti-RBD o anti-flagelina circulante que de huIgG fue incongruente con las expansiones clonales de células B huIgA+ y huIgG+ comparables, las cargas mutacionales de huIgA y huIgG y huIgA y huIgG Números ASC. Sin embargo, es consistente con el nivel más bajo de huIgA anti-RBD que de huIgG en la sangre y la saliva de humanos vacunados con mRNA dCOVID-19(56,57), así como con el nivel más bajo de huIgA antiflagelina que de huIgG en humanos infectados con Salmonella(58). La utilización predominante de los genes V3, V4 y V1 por parte de los anticuerpos de cambio de clase en ratones THX vacunados con mRNACOVID-19 evoca una utilización similar del gen V por parte de la respuesta de anticuerpos de cambio de clase en humanos vacunados con mRNA de COVID-19(59). La carga mutacional de más de 10-2 cambios por base en las transcripciones de huVHDJH-Cγ de células huB en ratones THX vacunados con mRNA de COVID-19 y RBD-KLH también evoca la gran carga mutacional de la huIgG inducida por la vacuna de mRNA COVID-19 en humanos(59,60,61), lo que posiblemente refleja la alta inmunogenicidad de Spike S1 RBD(62,63).
Los ratones humanizados generalmente carecen de huMHC tímicos, lo que da como resultado células huT seleccionadas en MHC de ratón, una deficiencia que se corrige mediante injertos de fragmentos de timo humano, como en los ratones BLT5. Las respuestas de anticuerpos maduros de ratón THX inducidas por NP16-CGG, flagelina de Salmonella y mRNA de Pfizer COVID-19 presumiblemente dependían de células T CD4+ formadas en huTEC u otras células humanas que expresan MHC clase II(40,41,42), como células huB y huDC, también presente en el timo del ratón THX. Pero, ¿cómo podrían los ratones THX poblar su timo con huTEC, que supuestamente surgen de progenitores CD34- no hematopoiéticos? De hecho, las células epiteliales pueden diferenciarse de las células madre CD34+, incluidas las células CD34+ de la sangre del cordón umbilical(64,65,66), dando lugar posiblemente a huTEC. Curiosamente, los TEC expresan ERα y ERβ, lo que coincide con el papel de E2 en la promoción de su diferenciación(67).
La maduración de la respuesta de anticuerpos en ratones THX implicó el aumento en sangre de huAPRIL y huBAFF en concentraciones fisiológicas humanas. APRIL apoya la proliferación de células B, la CSR y la diferenciación de PC, mientras que BAFF apoya la supervivencia de las células B inmaduras, la diferenciación de las células B y la producción de anticuerpos(68).Los ratones THX vacunados con flagelina y con mRNA COVID-19 mostraron concentraciones comparables de huAPRIL en sangre. El primero, sin embargo, mostró niveles más altos de huBAFF circulante, lo que probablemente refleja la inducción de flagelina de esta citocina de células B(69). En ratones THX, huAPRIL y huBAFF ocurrieron junto con huTGF-β, huIFN-γ, huIL-2, huIL-4, huIL-6 y huIL-10, todos a niveles fisiológicos humanos y, posiblemente, promovidos por la señalización ERα(14,19 ,20,49). Los niveles fisiológicos de factores de crecimiento de células B y citocinas humanas en ratones THX contrastan con los niveles generalmente desregulados de factores de crecimiento y citocinas transgénicos o knock-in en otros ratones inmunizados(5), como lo ejemplifica la expresión suprafisiológica del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humanos (huGM -CSF) y huIL-3 en ratones huNSG-SGM3, huGM-CSF, huIL-3 y huIL-6 en ratones huMISTRG(6) o huBAFF (TNFS13B) en ratones huBAFFKI70.
Una deficiencia de los ratones humanizados ha sido la falta de GC, lo que contribuye a alterar las respuestas de los anticuerpos(5). En ratones THX, E2 apoya la diferenciación de células huTFH, que producen citocinas, como IL-4, IL-6, IL-10 e IL-21, y promueven de manera crítica la diferenciación de células GC huB, la formación de GC, la maduración de la afinidad de BCR y la generación de PC y MBC(71,72). E2 promueve la expansión de las células TFH a través de PPARγ, apoyando así la respuesta de anticuerpos de cambio de clase(49,73). En las huPBMC activadas, E2 aumenta no solo las células PD-1+CXCR5+ TFH sino también las células ICOS+ TFH, ambas importantes para la formación de GC(49,72). Además, E2 mejora la expresión de CXCR4 y CXCR5, que son fundamentales para la organización de las zonas claras y oscuras de GC, así como para la localización de las células T mediante la modulación de la expresión de los receptores de quimiocinas de las células T, como CCR5 (refs. 49, 74). Finalmente, E2 aumenta la expresión de CD154 de las células T CD4+(22) y regula positivamente la histona metiltransferasa EZH(2), lo que ayuda a la diferenciación de las células TFH(75).
Otro defecto de los ratones humanizados es el escaso desarrollo de las células mieloides humanas, en particular de los neutrófilos(5). La expresión de huGM-CSF y huIL-3 en ratones NSG-SGM3 y MISTRG humanizados mieloablados con radiación γ, así como la expresión adicional del factor estimulante de colonias de granulocitos humanos (hG-CSF), como en ratones MISTRGGR humanizados, ha corregido parcialmente la mieloide humana. subrepresentación celular(5,76). Los neutrófilos expresan tanto ERα como ERβ(20,25,26), y se ha demostrado que el estrógeno aumenta los neutrófilos en la sangre periférica de las mujeres y en la sangre, la MO y el bazo de los ratones(25). Los ratones THX reconstituyeron neutrófilos humanos en casi una cuarta parte de las células huCD45+ del bazo, una proporción comparable a la de los neutrófilos en el bazo de los humanos(31). Finalmente, las plaquetas humanas en ratones THX representaron aproximadamente un tercio del total de plaquetas, posiblemente también como resultado del impacto directo de E2 sobre los megacariocitos, que expresan ERα y ERβ y cuya maduración es impulsada por los estrógenos(77).
El microbioma intestinal del ratón THX, que estaba formado por Muribaculaceae y otras familias de bacterias encontradas en humanos, difería profundamente del microbioma de los ratones NBSGW, que estaba dominado por las exquisitas Rikenellaceae «murinas». Por el contrario, compartía bacterias, incluidas las Muribaculaceae dominantes, con los ratones huNBSGW, que, posiblemente reflejando la falta de acondicionamiento E2, también albergaban restos de Rikenellaceae, que no se encuentran en los ratones THX. El microbioma intestinal similar al humano, junto con la huIgD y la huIgA fecales libres y unidas a bacterias, probablemente inducidas por la estimulación microbiana de los TLR de las células linfoides intestinales(38,39,78), sugiere que los ratones THX son adecuados para modelar las respuestas de anticuerpos de la mucosa intestinal humana. Sin embargo, se necesita más investigación para dilucidar los mecanismos que sustentan la contribución de E2 a la configuración del microbioma del ratón THX en el intestino y las vías respiratorias y, posiblemente, la contribución potencial de E2 para respaldar las huILC y las células T residentes periféricas, ambas importantes en la homeostasis y la defensa de la mucosa.
Los modelos murinos de lupus, como MRL/lpr y los ratones Sle1, Sle2 y Sle3 genéticamente modificados, comparten un sistema inmunológico no humano, que media una respuesta de autoanticuerpos que no reproduce fielmente la de los individuos con LES. El estrógeno desempeña un papel en la aceleración de la autoinmunidad del lupus en ratones y puede desempeñar un papel en el desarrollo del lupus humano(16,17,19,23,43,79). E2 mejora la producción de anticuerpos anti-ADNbc en células huB de lupus y ERα acelera el desarrollo del lupus en ratones F1 autoinmunes (NZBxNZW) de forma intrínseca a las células B(17,20,79). De acuerdo con la expansión clonal de las células B en individuos con lupus, los ratones Lupus THX expandieron y diversificaron intraclonalmente células B selectas huIgG+ y huIgA+ y produjeron autoanticuerpos de cambio de clase contra los componentes nucleares de las células, lo que finalmente condujo a síntomas e inmunopatología similares al lupus. Al superar las limitaciones planteadas por las diferencias entre el lupus de ratón y el humano(-43), los ratones Lupus THX se prestarían para probar nuevos enfoques terapéuticos con traducibilidad inmediata a individuos con lupus. También proporcionarían una primera prueba de concepto de ratones THX que modelan enfermedades humanas.
Por lo tanto, los ratones THX logran una reconstitución sostenida del sistema inmunológico humano y expresan repertorios huBCR y huTCR tan diversos como los de los humanos. Revelan y aprovechan una actividad estrogénica crítica para promover la diferenciación de las células inmunes humanas, así como la maduración de las respuestas de anticuerpos y autoanticuerpos humanos. Los mecanismos por los cuales E2 apoya estos procesos y el incremento de citocinas humanas relevantes aún no se han definido con más detalle, al igual que los posibles efectos secundarios a largo plazo de E2(16,52), que, sin embargo, no se observaron en ratones THX. Por lo tanto, al superar las limitaciones de los modelos de ratón humanizados actuales, los ratones THX proporcionan una plataforma avanzada y poderosa para estudios in vivo de respuestas inmunes humanas, particularmente respuestas de anticuerpos y autoanticuerpos, para el desarrollo de vacunas humanas y terapias inmunes, incluidos moduladores de enfermedades humanas con respuestas de anticuerpos no deseadas.
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