Ronald Palacios Castrillo
Resumen
La terapia génica (GT) de células madre hematopoiéticas (HSC) puede proporcionar una reconstitución de por vida del sistema hematopoiético con células corregidas genéticamente.
Sin embargo, los efectos de las enfermedades genéticas subyacentes, el estrés de replicación y el envejecimiento en la reconstitución hematopoiética y la especificación del linaje siguen sin estar claros.
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En este estudio, Calabria,et.al.,[ Nature 636, 162–171 ,2024] analizaron la reconstitución hematopoiética en 53 Pacientes tratados con lentiviral-HSC-GT para diversas afecciones, como leucodistrofia metacromática (MLD), síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) y β-talasemia6 (β-Thal) durante un período de seguimiento de hasta 8 años , utilizando sitios de integración de vectores como marcadores de identidad clonal. Calabria,et.al.,[ Nature 636, 162–171 ,2024] descubrieron que la reconstitución hematopoiética a largo plazo estaba respaldada por entre 770 y 35 000 células madre hematopoiéticas activas.
Mientras que el 50% de los clones trasplantados demostraron potencial multilinaje en todas las condiciones, los clones restantes mostraron un resultado de linaje preferencial específico de la enfermedad y un compromiso a largo plazo: mieloide para MLD, linfoide para WAS y eritroide para β-Thal, particularmente en pacientes adultos.
Estos resultados indican que la actividad clonogénica de las HSC, la producción de linaje, el compromiso de linaje a largo plazo y las tasas de mutaciones somáticas están influenciadas por la enfermedad subyacente, la edad del paciente en el momento de la terapia, el grado de corrección del defecto genético y el estrés hematopoiético impuesto por la enfermedad hereditaria.
Esto sugiere que las células madre hematopoiéticas se adaptan a la condición patológica durante la reconstitución hematopoiética.
En Detalle
En la terapia génica (GT) de células madre hematopoyéticas (HSC-GT), se utilizan vectores virales integradores para introducir material genético terapéutico en células madre y progenitoras hematopoiéticas (HSPC) de pacientes afectados por trastornos hereditarios y restaurar la función defectuosa.
Las HSPC autólogas corregidas genéticamente se injertan, se auto-renuevan y dan lugar a todas las células de la sangre y del sistema inmunológico, lo que proporciona beneficios terapéuticos a largo plazo a los pacientes.
La HSC-GT es una opción de tratamiento eficaz para varias enfermedades monogénicas, incluidos trastornos sanguíneos, como inmunodeficiencias primarias y hemoglobinopatías, en las que las HSPC administradas restauran la funcionalidad de los linajes defectuosos, y enfermedades no hematopoiéticas, como trastornos de almacenamiento lisosomal, en los que la progenie de HSPC transducidas, como monocitos y macrófagos, realiza la depuración del material almacenado y administra la enzima terapéutica para realizar la corrección cruzada de otras células hematopoiéticas y no hematopoiéticas en los tejidos.
Para evaluar la seguridad y la eficacia del tratamiento y arrojar luz sobre la biología de la hematopoiesis en diversas enfermedades, es importante comprender cómo se produce la reconstitución hematopoiética en términos de producción y compromiso de linaje, cinética, composición clonal y sucesión.
En pacientes que reciben GT, se ha analizado el proceso de reconstitución hematopoiética mediante el seguimiento de los sitios de integración del vector viral (IS) recuperados de sangre periférica completa (PB) y médula ósea (BM) y linajes celulares purificados reunidos en puntos temporales secuenciales después de la reinfusión.
De hecho, debido a que las integraciones del vector ocurren de forma semialeatoria en las células huésped, cada IS representa un marcador distinto de identidad clonal que se mantiene de forma estable a lo largo del tiempo y es heredado por toda su progenie.
La secuenciación de alto rendimiento y el mapeo de las uniones entre el vector integrado y el genoma celular del huésped permitieron la recuperación e identificación de cientos de miles de IS que se utilizan para monitorear la composición clonal durante la reconstitución hematopoiética, el potencial multilinaje de los subconjuntos de HSPC y las relaciones jerárquicas entre los linajes hematopoiéticos.
Estudios previos de rastreo clonal en pacientes que recibieron HSC-GT afectados por deficiencias inmunitarias primarias, incluyendo inmunodeficiencia combinada grave de adenosina-desaminasa (SCID), SCID tipo 1 ligada al cromosoma X (XSCID) y síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), en el que las células B y T están profundamente deterioradas, han demostrado claramente una ventaja selectiva de las células linfoides modificadas genéticamente después del trasplante, lo que indica que el trasfondo de la enfermedad influye en la proporción y el tipo de células comprometidas con el linaje durante largos períodos de tiempo.
Por otra parte, en otras enfermedades como la enfermedad granulomatosa crónica, un trastorno fagocítico progresivo o leucodistrofias y trastornos de almacenamiento lisosomal no se observó ninguna ventaja selectiva en el crecimiento o la supervivencia en ningún linaje celular.
Se realizaron análisis comparativos del compromiso de linaje de HSPC en unos pocos estudios con un número limitado de pacientes, principalmente en inmunodeficiencias primarias como WAS y hemoglobinopatías (β-talasemia (β-Thal) y enfermedad de células falciformes).
También es relevante comprender cómo el estrés replicativo impuesto por la reconstitución hematopoiética afectaría el potencial multilinaje de las HSPC, la dinámica del compromiso de linaje y, en última instancia, la seguridad a largo plazo, y cómo esto puede variar en diferentes condiciones de la enfermedad.
De hecho, los pacientes con enfermedad de células falciformes tienen un mayor riesgo de desarrollar neoplasias hematológicas y una mayor frecuencia de clones hematopoiéticos con mutaciones impulsoras asociadas con cáncer mieloide o hematopoiesis clonal, como se observó en pacientes no tratados y tratados que recibieron GT.
Aún falta una comparación exhaustiva de la reconstitución hematopoiética en diferentes antecedentes patológicos con grandes cohortes de pacientes, que incluyan trastornos hematopoiéticos y no hematopoiéticos y con o sin ventaja selectiva y diferentes cantidades de estrés hematopoiético.
Calabria,et.al.,[ Nature 636, 162–171 ,2024] reportan un análisis comparativo de la reconstitución hematopoiética a nivel clonal en 53 pacientes incluidos en tres HSC-GT basados en vectores lentivirales distintos para leucodistrofia metacromática (MLD, un trastorno neurodegenerativo de almacenamiento lisosomal), WAS y β-Thal realizados por nuestra institución y, para ampliar y validar aún más algunos hallazgos, de diez pacientes con XSCID tratados con HSC-GT basados en vectores lentivirales en otra institución y publicados previamente.
Los resultados revelan que el resultado a largo plazo, el compromiso de linaje de las HSPC y la acumulación de mutaciones somáticas están fuertemente modulados por los antecedentes genéticos de los pacientes, posiblemente para compensar mejor las demandas planteadas por la condición clínica específica.
En este trabajo, Calabria,et.al.,[ Nature 636, 162–171 ,2024] llevaron a cabo un análisis detallado de las integraciones de vectores lentivirales en linajes de células mieloides, linfoides y eritroides terminalmente diferenciadas, así como de células madre hematopoiéticas CD34+ purificadas de médula ósea o recolectadas en líquido amniótico de pacientes sometidos a HSC-GT para MLD, WAS y β-Thal.
Gracias a la gran cantidad de pacientes y clones rastreados durante períodos prolongados de tiempo (hasta 8 años desde la terapia), este trabajo constituye un conjunto de datos grande y altamente detallado que aborda la seguridad y la dinámica del injerto y, en consecuencia, la perspectiva de seguridad general del vector lentiviral-HSC-GT.
Al utilizar los IS como marcadores clonales únicos, confirmaron y proporcionan más evidencia de la eficacia y seguridad a largo plazo de la GT en pacientes con MLD, WAS y β-Thal y brindan información biológica sobre la reconstitución hematopoiética y el compromiso de linaje en los diferentes contextos de la enfermedad, modulados aún más por los protocolos de acondicionamiento específicos y la edad de los pacientes en el momento del tratamiento ..
Los estudios realizados por los autores y otros han resaltado diferentes tasas de división celular y características de latencia de distintos subconjuntos de HSPC, lo que explica la meseta que se observa en la mayoría de los pacientes con el cambio de HSC de corto a largo plazo durante la ventana de tiempo de 12 a 24 meses. Un paciente con WAS (Pt17) y dos con β-Thal (Pt36 y Pt41) mostraron una recuperación continua de nuevos IS más allá de los 24 meses y hasta el último seguimiento, alcanzando hasta 450000 IS.
Cabe destacar que estos aumentos en nuevos IS pueden no plantear problemas de seguridad per se, al contrario de la creciente abundancia de un único IS. Las razones biológicas detrás de estas excepciones aún están por explicar, pero sugieren un número particularmente alto de HSC modificadas genéticamente que fueron injertadas y continúan siendo reclutadas para la producción de células sanguíneas.
Las posibles explicaciones incluyen una mayor frecuencia de HSC basal dentro de las células CD34+ transducidas, una mayor permisividad de estas HSC al proceso de ingeniería ex vivo o un injerto más eficiente, por ejemplo, por una persistencia in vivo prolongada después de la infusión y/o la disponibilidad de espacio de nicho adicional en estos pacientes.
En este estudio, el número de HSPC activas durante la hematopoiesis en estado estacionario en pacientes varió de 1.800 a 74.000, lo que representa aproximadamente entre el 0,0007 y el 0,03 % del total de células CD34+ infundidas.
Se observó una correlación positiva entre el número estimado de HSC y el total de células CD34+ infundidas, sin evidencia de saturación incluso con dosis altas. Los pacientes con β-Thal, que recibieron las dosis más altas de células CD34+, mostraron estimaciones de HSC significativamente más altas que los pacientes con MLD y WAS.
Sin embargo, cuando se normalizó al número total de células CD34+ infundidas, la frecuencia de HSC fue similar en las tres enfermedades, independientemente de si las HSPC se recolectaron de BM o MPB. Esto sugiere que las dosis más altas de células CD34+ son beneficiosas para la terapia génica, ya que no saturan los nichos de células madre y pueden proteger contra la hematopoiesis clonal y la malignidad.
Este estudio también destaca las ventajas de usar células CD34+ derivadas de MPB en la terapia génica, ya que producen más células trasplantables y pueden permitir una recuperación más rápida de las células sanguíneas.
Además, el mayor número de HSPC activas en pacientes con β-Thal puede deberse a un injerto más eficiente mediante infusión intraósea en comparación con la infusión intravenosa aunque la superioridad de este método en el injerto a largo plazo sigue siendo objeto de debate.
El número estimado de HSPC y su frecuencia en el producto infundido coinciden con los hallazgos previos en pacientes con leucemia mieloide crónica, síndrome de Wahlgren-Schneider y β-Thal, y en pacientes que recibieron GT para anemia de células falciformes. Sin embargo, los estudios de hematopoiesis nativa en donantes sanos sugieren un número mayor de HSPC, que oscila entre 20 000 y 200 000: dos a diez veces más que en pacientes que recibieron GT-HSC.
Las estimaciones más bajas de HSPC en pacientes que recibieron GT-HSC pueden deberse a una subestimación en pacientes jóvenes, a la competencia por el injerto en nichos dañados o a los efectos perjudiciales del cultivo ex vivo y la transducción del vector lentiviral sobre la pluripotencia.
Además, el número de clones persistentes después de la reconstitución hematopoiética superó las estimaciones iniciales de HSPC, lo que sugiere que los métodos de captura-recaptura pueden subestimar el número real de HSC.
Los autores encontraron que, para todas las enfermedades analizadas, la producción de HSPC con potencial multilinaje representó solo el 50% de los clones, mientras que el 50% restante estuvo constituido por clones comprometidos con un linaje específico y con diferencias específicas entre los programas clínicos.
En pacientes con MLD, WAS y β-Thal, la hematopoiesis mostró una producción preferencial y un compromiso de linaje hacia los linajes mieloide, linfoide y eritroide respectivamente, incluso después de años desde el tratamiento.
Es importante señalar que clasificaron los clones de HSPC como multilinaje si se detectan en al menos dos linajes maduros, en lugar de en los cuatro linajes analizados. Esta elección está impulsada por la alta policlonalidad de sus pacientes, que reduce la recaptura en los cuatro linajes, mientras que los estudios de seguimiento de códigos de barras en modelos animales mostraron una mayor sensibilidad.
Estos sesgos persistentes pueden estar influenciados por el tipo de enfermedad, la edad a la que se produce el tratamiento y la corrección incompleta de la enfermedad después de la terapia.
En pacientes con leucemia mieloide crónica (LMD), se observó una cantidad significativa de clones mieloides de larga duración poco después del trasplante, de acuerdo con informes previos sobre modelos de ratón, y los pacientes mayores (de 2 a 15 años) mostraron mayores cantidades de estas células mieloides en comparación con los pacientes más jóvenes (de 0 a 2 años).
Esta diferencia puede atribuirse a la acumulación de la carga de la enfermedad con la edad, que causa una inflamación crónica que prepara a las HSPC para la diferenciación mieloide. A pesar de esto, el equilibrio general entre clones multilinaje y unilinaje permanece estable con el tiempo, lo que indica un equilibrio homeostático a largo plazo.
Por el contrario, los pacientes con WAS y los que recibieron XSCID, tratados con acondicionamiento de intensidad reducida, mostraron una rápida repoblación linfoide, particularmente en células T, debido a la ventaja selectiva de las células corregidas genéticamente y los efectos de los agentes de depleción linfoide.
Los pacientes del estudio β-Thal mostraron el escenario más complejo en el que la producción y el compromiso del linaje están influenciados por factores como la edad en el momento del tratamiento y los resultados terapéuticos.
Los pacientes adultos con β-Thal, que siguieron dependiendo de transfusiones, mostraron un aumento significativo en la producción de linaje eritroide con el tiempo, mientras que los pacientes más jóvenes (de 4 a 13 años) tuvieron una producción eritroide menor pero estable, lo que sugiere una correlación con la presencia residual de eritropoiesis ineficaz6.
A pesar de la producción normal del linaje de células B, los pacientes con β-Thal mostraron mayores cantidades de clones comprometidos de células B de larga vida, de acuerdo con otros informes sobre modelos animales, lo que indica que la enfermedad afecta tanto a los linajes eritroides como a los de células B.
Además, los pacientes mayores con β-Thal demostraron un mayor compromiso unimieloide y contribuciones reducidas de múltiples linajes en comparación con los pacientes más jóvenes, lo que sugiere que la edad en el tratamiento o los resultados terapéuticos juegan un papel en el compromiso de linaje.
La producción y el compromiso de HSPC estables pero alterados observados en pacientes con WAS y β-Thal a lo largo del tiempo indican que el microambiente de la médula ósea y las citocinas específicas pueden impulsar el compromiso a largo plazo con los linajes más necesarios, lo que refleja una normalización incompleta de la hematopoiesis después de la terapia.
De acuerdo con estas hipótesis, en pacientes con WAS, las concentraciones de TPO fueron inicialmente altas después de la GT, pero disminuyeron con el tiempo, lo que sugiere un éxito terapéutico parcial.
En pacientes con β-Thal, las concentraciones de EPO variaron, siendo normales en algunos pacientes pediátricos independientes de la transfusión, pero anormalmente altas en otros, particularmente en adultos e individuos dependientes de la transfusión.
Esto indica una correlación parcial entre las concentraciones de EPO y los resultados terapéuticos, con otros factores probablemente influyendo en el comportamiento de HSPC en β-Thal. Las señales ambientales, como los mitógenos y las citocinas, junto con factores intrínsecos o epigenéticos, pueden conducir a una producción sesgada pero no exclusiva de linajes maduros deficientes.
La mayor abundancia de estos linajes sugiere tasas de detección más altas, mientras que las contribuciones a otros linajes podrían caer por debajo del umbral de detección.
Los experimentos futuros destinados a analizar las firmas de expresión y los estados epigenéticos de los subconjuntos de HSPC en masa y a nivel de células individuales nos permitirán explicar mejor los mecanismos biológicos subyacentes a las diferencias biológicas en cada condición de enfermedad.
No se encontraron mutaciones somáticas dañinas de GT en pacientes con β-Thal y MLD, pero los pacientes con β-Thal tenían significativamente más mutaciones somáticas que aquellos con MLD, probablemente debido al estrés hematopoiético del daño oxidativo relacionado con la sobrecarga de hierro, que podría resultar en mayores cantidades de daño del DNA genómico y mitocondrial y erosión de los telómeros, previamente informados solo en leucocitos, y el nicho de BM alterado.
A pesar de estas diferencias específicas de la enfermedad, se demostró que la modificación genética basada en vectores lentivirales de HSPC y su trasplante preservan la capacidad de las células para responder a las demandas de la enfermedad y los estresores ambientales.
Un aspecto importante de este estudio es que, a pesar de las diferencias observadas en estas enfermedades, la modificación genética de las HSPC mediante vectores lentivirales y su trasplante no perjudican su notable capacidad para responder a las demandas impuestas por las enfermedades genéticas y la capacidad de responder a las infecciones y al daño ambiental.
De hecho, las HSPC modificadas genéticamente con potencial multilinaje, una vez alcanzada la estabilidad, contribuyeron a aproximadamente el 50% de la hematopoiesis, mientras que los clones restantes se comprometieron.
El concepto de que las LT-HSC son las únicas contribuyentes a la hematopoiesis ya ha sido cuestionado y las observaciones de este trabajo refuerzan la hipótesis de que en puntos temporales tardíos después del trasplante, la hematopoiesis se mantiene mediante muchas HSPC comprometidas con el linaje capaces de persistir durante varios años sin evidencia de dominancia clonal después de varios años desde el trasplante.