Conceptos claves para comprender mejor este artículo:
Acondicionamiento
Término utilizado para describir un curso de tratamiento que comprende uno o más medicamentos administrados a los pacientes antes del trasplante alogénico o autólogo de células madre hematopoiéticas (HSC). Por lo general, se dan los agentes alquilantes como el busulfán que eliminan las HSC para «hacer espacio» para las HSC trasplantadas. Para la mayoría de los receptores de trasplantes alogénicos, se administran agentes adicionales para eliminar las células inmunitarias y prevenir el rechazo inmunológico del injerto.
Oncogénesis por inserción de vectores (Una inducción de cáncer hematológico causado por el vector de inserción):
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Los virus se insertan en diferentes ubicaciones cromosómicas en cada célula infectada y según patrones específicos del tipo de virus. Por ejemplo, los retrovirus gamma se han asociado con oncogénesis insercional en ensayos de terapia génica que usan HSC ,como resultado de su tendencia a insertarse cerca del sitio de inicio de la transcripción de los genes, induciendo cambios aberrantes de la expresión del gene vecino, y potencialmente de darle a ese clon una ventaja de supervivencia. Los lentivirus tienden a insertarse dentro de las regiones codificantes de los genes.
Informes de la oncogénesis insercional han sido raros, al igual que los informes de expansión clonal debido a empalmes aberrantes asociados con la inserción de un transgene.
Promotores sintéticos
Secuencias genéticas compuestas por elementos reguladores que generalmente no se encuentran juntos en la naturaleza y que promocionan la expresión de un gene adyacente. Estos elementos pueden incluir fragmentos de promotores, potenciadores (enhancers) ó sitios de unión a microRNA ó pueden ser producto de nueva ingeniería genética.
VDJ recombinación
Un proceso que implica cortar y volver a unir los loci que codifican receptores para el reconocimiento de antígenos en los linfocitos T y linfocitos B. Estos loci son altamente polimórficos y contienen múltiple regiones,variable (V), regiones de diversidad (D), y regiones de unión (J), flanqueadas por secuencias de señales de recombinación (RSS). Cada célula T y B en desarrollo reorganiza el locus para generar una transcripción única que contiene una región V, una D y una J, un proceso conocido como recombinación VDJ. El complejo de las proteínas RAG1-RAG2 inicia este proceso cortando el DNA en los sitios RSS.
Introducción
Los bebés con inmunodeficiencia combinada severa (SCID), una enfermedad caracterizada por una falla en el desarrollo de células T, mueren de infección oportunista a menos que reciban tratamiento. El trasplante alogénico estándar de células hematopoiéticas tiene limitaciones debido a las diferencias inmunológicas entre el paciente y el donante. La forma de SCID ligada al cromosoma X es causada por variantes dañinas hemicigóticas en el gen IL2RG (que codifica la cadena γ del receptor de interleucina-2) y SCID deficiente en adenosina desaminasa (ADA-SCID)es causada por variantes dañinas bialélicas en el gen ADA (que codifica la adenosina desaminasa). Ambos tipos de enfermedades han sido tratados exitosamente con terapia génica autóloga (4).
Cowan y colegas(5) reportaron recientemente sobre el tratamiento de un tipo de SCID sensible a la radiación conocido como SCID por deficiencia de Artemisa (ART-SCID) . Esta enfermedad es causada por variantes dañinas en el gene DCLRE1C, que codifica la proteína Artemis, y es difícil de tratar.
¿Qué hace Artemisa?
El desarrollo y la función de las células T y B dependen de la recombinación de genes variables (V), de diversidad (D) y de unión (J) (ver Conceptos clave), un proceso que genera células T y células B con receptores únicos y específicos de antígeno. Después de que los genes (RAG1) y 2 (RAG2) que activan la recombinación VDJ en linfocitos hacen rupturas del DNA de doble cadena en las regiones VDJ de los genes que codifican los receptores de células T y células B, Artemisa (una endonucleasa involucrada en la reparación general del DNA) se activa, lo que permite la unión de los extremos cortados y la expresión de los receptores reorganizados. La deficiencia de RAG1, RAG2 o Artemis dá como resultado una falla en el desarrollo de células T y células B.
¿Por qué la ART-SCID es difícil de tratar?
Debido a que Artemis es fundamental para la respuesta general a la radiación y otros inductores de daño en el DNA (como el busulfán, que generalmente se usa en los regímenes de acondicionamiento), los pacientes con ART-SCID tienen manifestaciones clínicas fuera del sistema inmunitario y son susceptibles a mayores efectos tóxicos. Un desafío adicional es que los pacientes con ART-SCID, a diferencia de los pacientes con otras formas de SCID, requieren acondicionamiento para el injerto (El acondicionamiento implica el eliminar células de la médula ósea para crear espacio para las células madre transferidas adoptivamente). Complicaciones particulares, como anomalías dentales, crecimiento deficiente y endocrinopatías, pueden ocurrir con mayor frecuencia en pacientes con ART-SCID porque las células de estos pacientes son muy sensibles al daño en el DNA que causa el acondicionamiento con Busulfan .
¿Cómo se llevó a cabo la terapia génica?
Procedimiento de terapia génica para ART-SCID.
Cowan et al. usó un vector viral integrador para lograr la «adición» de genes (Figura 1). La adición de genes aprovecha las propiedades naturales de ciertos tipos de virus, incluidos los lentivirus, para integrarse en el genoma del paciente de forma semialeatoria. Cowen et al. eliminó los genes codificadores de un lentivirus, los reemplazó con DCLRE1C y luego infectó las propias células madre hematopoiéticas (HSC) del paciente con el vector viral. La integración exitosa en el genoma de una HSC determinada permite que el gene terapéutico se propague a toda la progenie sanguínea madura de esa célula HSC a largo plazo.
¿Cómo se purificaron las HSC de los pacientes?
Cowan et al. aplicaron un sistema que usaba perlas magnéticas recubiertas con un anticuerpo que se une a CD34 (Figura 1). Debido a que las HSC expresan CD34, se adhieren a la perla magnética. Luego, las células se infundieron a través de una columna y se aplicó un imán externo para aislar las HSC de otros tipos de células y componentes del plasma. Luego, las HSC se purificaron liberando el imán y lavando.
Después de la purificación, las HSC se estimularon con citoquinas durante la noche, se infectaron (transdujeron) con el vector viral, se lavaron y congelaron. Las muestras de HSC se habían testeado de antemano para probar la esterilidad y el nivel deseado de eficiencia de transducción. Si estas pruebas cumplían con los criterios para el tratamiento, el paciente ingresaba en el hospital y recibía acondicionamiento con busulfán en dosis bajas para eliminar al menos una parte de las HSC, creando así una «apertura» para las HSC modificadas. Luego, las células modificadas genéticamente se descongelaron y se infundieron por vía intravenosa.
¿Alguna característica especial del ensayo de terápia génica?
Una característica novedosa de este ensayo de terapia génica es el uso de un promotor específico de gene endógeno para controlar la expresión génica. Cowan et al. usó el elemento de DNA regulador que normalmente se encuentra junto a DCLRE1C (en lugar de un elemento regulador viral o promotor de otro gene humano, por ejemplo). Experimentos anteriores han demostrado que es importante tener la cantidad justa de Artemis: ni mucho ni demasiado poco. El promotor endógeno parecía ser una buena opción para obtener la expresión fisiológica y evitar los efectos tóxicos infligidos por la sobreexpresión(6,7).
Un informe reciente que implica a un promotor viral potente en la aparición de oncogénesis por inserción en un ensayo de terapia génica lentiviral para la adrenoleucodistrofia apoya aún más la seguridad de usar un promotor más débil endógeno(8).
Otros vectores desarrollados recientemente tienen transgenes que han sido “optimizados por codones”. Este proceso implica el cambio de nucleótidos en la secuencia de una manera que favorece los codones que están muy representados en las células de mamíferos, lo que conduce a niveles más altos de proteína por copia del transgene. La optimización de codones aprovecha la redundancia en el código genético; los nuevos codones son sinónimos de los que reemplazan. Cowan et al., sin embargo, no alteraron la copia terapéutica de DCLRE1C porque buscaban un nivel fisiológico de expresión. El hecho de que la mayoría de las células T y B de los pacientes tuvieran tres o más copias de DCLRE1C terapéutico, en lugar de las dos copias de las células normales, sugiere que no se logró una verdadera expresión endógena y que en algún momento durante el desarrollo, se requirieron tres o más copias para permitir la maduración del linfocito.
Los sitios de integración del vector son únicos para cada célula transducida y pueden interrumpir de forma esperada o inesperada la regulación o expresión del gene donde se inserta el vector. En un ensayo reciente de terápia génica lentiviral para SCID ligada al cromosoma X, se demostró que los aisladores (elementos destinados a evitar la activación no deseada de genes vecinos) inducen un empalme aberrante y una expansión clonal(3). La simplicidad del vector ART-SCID en este sentido es favorable en términos de seguridad. Otras características que mejoran la seguridad, la eficiencia y el potencial para la futura comercialización del vector ART-SCID incluyen la exposición más baja a busulfán de cualquier ensayo de terápia génica hasta la fecha, el corto período de transducción y cultivo, y la crioconservación del producto, lo que podría permitir envío a otros sitios para infusión.
¿Qué sigue?
Se están estudiando o desarrollando nuevos vectores que usan promotores sintéticos, quiméricos o específicos del tipo de célula para lograr el patrón deseado de expresión de proteína necesario para la eficacia terapéutica (p. ej., niveles endógenos fisiológicos o, en algunos casos, suprafisiológicos). La edición de genes, en la que las modificaciones se realizan directamente en el gene objetivo, se está buscando activamente. Lo que es más importante para los trastornos sensibles a la radiación como ART-SCID, se espera que los agentes acondicionadores no tóxicos que reemplazen al busulfán cambien la forma en que se realizan tanto el trasplante de células hematopoiéticas como la terápia génica, evitando los efectos tóxicos a corto y largo plazo y el incremento de la población de pacientes que pueden ser tratados con seguridad.
Ronald Palacios Castrillo, M.D., PhD.
Referencias Bibliográficas
- Hacein-Bey-Abina S, Garrigue A, Wang GP, et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest 2008;118:3132-3142.
- Orchard Therapeutics. Orchard statement on strimvelis, a gammaretroviral vector-based gene therapy for ADA-SCID. October 30, 2020.(https://ir.orchard-tx.com/node/7746/pdf)
- De Ravin SS, Liu S, Sweeney CL, et al. Lentivector cryptic splicing mediates increase in CD34+ clones expressing truncated HMGA2 in human X-linked severe combined immunodeficiency. Nat Commun 2022;13:3710-3710.
- Chetty K, Houghton BC, Booth C. Gene therapy for inborn errors of immunity: severe combined immunodeficiencies. Hematol Oncol Clin North Am 2022;36:813-827.
- Cowan MJ, Yu J, Facchino J, et al. Lentiviral gene therapy for artemis-deficient SCID. N Engl J Med 2022;387:2344-2355.
- Multhaup M, Karlen AD, Swanson DL, et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Hum Gene Ther 2010;21:865-875.
- Punwani D, Kawahara M, Yu J, et al. Lentivirus mediated correction of artemis-deficient severe combined immunodeficiency. Hum Gene Ther 2017;28:112-124.
- Servick K. Gene therapy clinical trial halted as cancer risk surfaces. Science. August 11, 2021.