Ronald Palacios Castrillo
Resumen
Los modelos celulares humanos de neurodegeneración requieren reproducibilidad y longevidad, lo cual es necesario para simular enfermedades dependientes de la edad. Estos sistemas son especialmente necesarios para las proteinopatías TDP-431, que implican mecanismos humanos específicos que no pueden estudiarse directamente en modelos animales.
Aquí, Hruska-Plochan,et.al.,(Nature 626, 1073–1083 ,2024). para explorar la aparición y las consecuencias de las patologías de TDP-43, generaron células madre neurales con morfología de colonia (iCoMoNSC) derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas mediante la selección manual de precursores neurales.
La transcriptómica unicelular y la comparación con células madre neurales independientes mostraron que las iCoMoNSC son excepcionalmente homogéneas y se renuevan a sí mismas.
Los iCoMoNSC diferenciados formaron un sistema multicelular autoorganizado que consta de neuronas electrofisiológicamente activas y conectadas sinápticamente, que maduraron hasta convertirse en redes funcionales de larga duración (que denominamos iNets).
La maduración neuronal y glial en iNets fue similar a la de los organoides corticales. La sobreexpresión de TDP-43 de tipo salvaje en una minoría de neuronas dentro de iNets provocó una fragmentación y agregación progresiva de la proteína, lo que resultó en una pérdida parcial de función y neurotoxicidad.
La transcriptómica unicelular reveló un nuevo conjunto de dianas de RNA mal reguladas en neuronas que sobreexpresan TDP-43 y en pacientes con proteinopatías de TDP-43 que exhiben una pérdida de TDP-43 nuclear.
El objetivo mal regulado más fuerte codificaba la proteína sináptica NPTX2, cuyos niveles están controlados por la unión de TDP-43 en su región 3′ no traducida. Cuando NPTX2 se sobreexpresó en iNets, mostró neurotoxicidad, mientras que la corrección de la mala regulación de NPTX2 rescató parcialmente a las neuronas de la neurodegeneración inducida por TDP-43.
En particular, NPTX2 se acumuló erróneamente de manera consistente en neuronas de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica y degeneración del lóbulo frontotemporal con patología TDP-43.
Este trabajo vincula directamente la mala regulación de TDP-43 y la acumulación de NPTX2, revelando así una vía de neurotoxicidad dependiente de TDP-43. Los autores proponen que NPTX2 es un objetivo neuronal clave de TDP-43, y que su aumento aberrante en las neuronas afectadas puede desencadenar una cascada patológica que conduzca a la pérdida neuronal en FTLD-ELA.
En este contexto, NPTX2 puede representar un objetivo terapéutico importante para las proteinopatías TDP-43, junto con STMN2 y UNC13A.
En Detalle
La proteína TDP-43 se acumula en las neuronas afectadas de pacientes con enfermedades neurodegenerativas, incluida la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia lobular frontotemporal (DLFT). TDP-43 es una proteína de unión a RNA esencial que se autorregula estrechamente mediante la unión a su propio mRNA.
En las células normales, TDP-43 es predominantemente nuclear y controla directamente el procesamiento de cientos de sus objetivos de RNA. Por el contrario, TDP-43 forma agregados patológicos en la enfermedad, que son neurotóxicos per se y presentan una potencia que se correlaciona con la duración de la enfermedad en pacientes con DLFT.
Además, los agregados atrapan el TDP-43 recién sintetizado, lo que provoca una eliminación nuclear y la pérdida de su función normal.
Esto tiene consecuencias perjudiciales, ya que conduce a una amplia mala regulación del empalme, incluida la inclusión de exones crípticos en objetivos específicos de RNA TDP-43 como STMN2 y UNC13A. Ambas dianas de RNA son neuronales y específicas de los humanos, y se encontró que sus niveles estaban significativamente reducidos en los cerebros de pacientes con proteinopatías TDP-43, lo que vincula directamente la pérdida de la función nuclear de TDP-43 con la neurodegeneración.
El reconocimiento de STMN2 y UNC13A motivó el desarrollo de modelos experimentales totalmente humanos para las proteinopatías de TDP-43 para descifrar los objetivos clave y los mecanismos patológicos posteriores de la mala regulación de TDP-43.
Los sistemas basados en células madre pluripotentes inducidas (iPS) ofrecen esta posibilidad, y en los últimos años se han logrado varios avances con esta tecnología, incluida la generación y caracterización de numerosas líneas celulares iPS de pacientes con ELA y DLFT (mediante el proyecto Answer ALS).
El reconocimiento de fenotipos neuronales tempranos en neuronas humanas con mutaciones ligadas a ELA y firmas transcriptómicas ligadas a enfermedades.
No obstante, la mayoría de los estudios con neuronas derivadas de células iPS de pacientes con proteinopatías TDP-43 han informado una patología TDP-43 baja o nula, potencialmente debido al estado de maduración temprana de las neuronas humanas en cultivo.
Las líneas de NSC autorrenovables a largo plazo derivadas de células madre humanas embrionarias o células iPS proporcionan una excelente fuente de células expandibles para crear modelos de neurogénesis y enfermedades relacionadas con el SNC.
En este reporte, generaron iCoMoNSC y demostraron que representan una población excepcionalmente homogénea de NSC autorrenovables con el potencial de dar lugar a subtipos neuronales y gliales maduros y diversos. En particular, solo un porcentaje muy pequeño (alrededor del 0,3%) de iCoMoNSC se identificó como neuroblastos comprometidos.
Tras la diferenciación terminal, las iCoMoNSC generaron consistentemente cultivos neuronales y gliales mixtos con neuronas electrofisiológicamente activas que formaron redes interconectadas con actividad coordinada espontánea, que llamamos iNets.
El análisis scRNA-seq confirmó la maduración progresiva de subtipos neuronales y gliales dentro de iNets, similar a la de los organoides del cerebro humano.
Las iNets tienen la ventaja de contener una amplia variedad de tipos de células, incluidas neuronas excitadoras e inhibidoras y diferentes tipos de glía, lo que refleja la heterogeneidad de los tipos celulares presentes en el cerebro humano y los organoides cerebrales.
Por lo tanto, las iNet son más relevantes para la detección de fármacos en el SNC que los monocultivos o cocultivos neuronales 2D tradicionales con un solo subtipo glial.
Además, al igual que los sistemas típicos de cultivo celular en 2D, se ha demostrado que las iNets son perfectamente adecuadas para rastrear axones y estudiar la conectividad de la red mediante placas HD-MEA, a diferencia de los sistemas 3D.
Los investigadores exploraron cómo la sobreexpresión de TDP-43 en una minoría de neuronas afectaría a las iNets con el tiempo, con el objetivo de simular la situación en el cerebro enfermo, que según se informa contiene solo el 2% de las células con patología TDP-43.
Después de cuatro semanas de sobreexpresión de TDP-43-HA, observaron una disminución en los niveles de TDP-43-HA soluble en paralelo con la agregación progresiva de TDP-43 insoluble y la fragmentación C-terminal1, así como la pérdida de TDP-43-HA en Células HA positivas. scRNA-seq reveló que las células con sobreexpresión y patología de TDP-43 se caracterizaban por un perfil transcripcional distinto, con regulación negativa de STMN2 y UNC13A2, lo que indica un mal funcionamiento de TDP-43.
Sin embargo, a diferencia de los datos de la eliminación directa de TDP-43, no pudimos detectar exones crípticos en iNets con expresión de TDP-43-HA, posiblemente debido a sus bajos niveles de expresión y su rápida degradación a través de la vía de descomposición mediada sin sentido. como se muestra en otros estudios.
Alternativamente, la pérdida de función como resultado de la sobreexpresión de TDP-43-HA en este período de tiempo puede ser más leve que una pérdida global de proteínas.
Otra posibilidad es que la sobreexpresión y la caída puedan provocar fenotipos posteriores similares (regulación positiva de NPTX2 y regulación negativa de STMN2 y UNC13A) a través de distintos mecanismos. De acuerdo con esta idea, los autores mostraron que el perfil transcripcional de iNets con pérdida de función pura de TDP-43 mediante eliminación y de iNets con patología de TDP-43 se superpone solo parcialmente, y que ambas condiciones imitan algunos de los cambios de RNA observados en los núcleos de neuronas con aclaramiento nuclear de TDP-43 en pacientes con DLFT-ELA.
En particular, el enfoque de los investigadores descubre un nuevo conjunto de genes regulados hacia arriba y hacia abajo después de la sobreexpresión de TDP-43.
Sorprendentemente, todos los principales RNA mal regulados eran objetivos directos de TDP-43, y previamente se había descubierto que la unión de la mayoría de estas moléculas de RNA estaba alterada en el cerebro humano con FTLD.
La comparación de los nuevos objetivos de RNA con datos de secuenciación de RNA de neuronas corticales negativas para TDP-43 de pacientes con FTLD-ALS identificó a NPTX2 como el RNA con regulación positiva más destacada. TDP-43 se une al mRNA de NPTX2 en su UTR 3′, un evento que se altera en FTLD.
El modo de unión y el aumento de los niveles de RNA de NPTX2 indican un mecanismo regulador distinto de la supresión de exones crípticos, que se ha demostrado para STMN2 y UNC13A2.
En cambio, la unión de TDP-43 en la UTR 3′ de NPTX2 podría afectar la estabilidad o el transporte del mRNA, aunque el mecanismo preciso será el foco de estudios futuros.
En particular, esta mala regulación condujo a una acumulación aberrante de la proteína NPTX2, que se observa constantemente no solo en nuestro modelo celular, sino también en los cerebros de pacientes con FTLD-ELA. De hecho, la acumulación de NPTX2 en pacientes marcó de manera confiable células con patología TDP-43, sin coagregación de las dos proteínas.
En particular, no se observó una acumulación aberrante de NPTX2 en asociación con otras proteinopatías, incluidas FTLD-FUS o FTLD-tau, lo que sugiere un vínculo específico con la mala regulación de TDP-43. Recientemente se demostró que NPTX2 está disminuido en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con DLFT genética sintomática, de una manera que se correlaciona con la gravedad clínica.
No se sabe si la acumulación de NPTX2 que se observa en la minoría de neuronas con patología TDP-43 está relacionada de alguna manera con la disminución global de los niveles de NPTX2 con la edad y en la demencia, lo que se cree que indica alteración sináptica general. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de una interacción entre los dos eventos a través de mecanismos de plasticidad sináptica homeostática, por ejemplo.
NPTX2 es una pentraxina neuronal y un gen temprano inmediato que está regulado por la actividad neuronal.
Es una lectina dependiente de Ca2+ que se secreta desde las terminales presinápticas, donde regula la sinaptogénesis y la señalización del glutamato a través de la agrupación de receptores AMPA. La unión de NPTX2 al receptor neuronal de pentraxina (NPTXR) media en el mantenimiento sináptico, la plasticidad y la especialización postsináptica tanto en las sinapsis excitadoras como inhibidoras. NPTX2 mejora la función del receptor 1 de glutamato y su regulación positiva provoca la remodelación sináptica mediante el reclutamiento de receptores AMPA (ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiónico) permeables al Ca2+ en la membrana neuronal.
Durante mucho tiempo se ha propuesto que la excitotoxicidad del glutamato es una de las principales vías patológicas que mata selectivamente a las neuronas vulnerables en la ELA y otras enfermedades neurodegenerativas.
De hecho, los datos indican que la sobreexpresión directa de NPTX2, que conduce a una acumulación similar de la proteína en el citoplasma y los procesos neuronales como observamos aguas abajo de la sobreexpresión de TDP-43, es neurotóxica en iNets.
En particular, esta toxicidad directa de NPTX2 fue más leve en comparación con la toxicidad desencadenada por TDP-43, que encontramos que se correlaciona con los niveles de sobreexpresión de TDP-43, bajo control regulador o promotor diferencial.
Este hallazgo sugirió que NPTX2 es uno de varios mediadores de la toxicidad de TDP-43 y potencialmente actúa de forma sinérgica con STMN2, UNC13A y posiblemente otros targets de TDP-43.
Sin embargo, corregir los niveles de NPTX2 solo con shRNA rescató significativamente la neurotoxicidad de TDP-43 en iNets, lo que indica que NPTX2 es un modificador importante de la toxicidad de TDP-43 en neuronas humanas. Dadas las limitaciones conocidas del silenciamiento de genes mediado por shRNA60, incluida la toxicidad fuera del objetivo, consideramos que este rescate consistente y significativo de las neuronas iNets es particularmente alentador.
Los esfuerzos futuros se centrarán en comprender el mecanismo molecular de la neurotoxicidad de NPTX2, el posible efecto sinérgico de la mala regulación de NPTX2, STMN2 y UNC13A en la enfermedad y probar regímenes alternativos para corregir NPTX2 en modelos de proteinopatía TDP-43.
Los autores proponen que NPTX2 es un objetivo neuronal clave de TDP-43, y que su aumento aberrante en las neuronas afectadas puede desencadenar una cascada patológica que conduzca a la pérdida neuronal en FTLD-ELA.
En este contexto, NPTX2 puede representar un objetivo terapéutico importante para las proteinopatías TDP-43, junto con STMN2 y UNC13A.