Resumen
El virus de Epstein-Barr (EBV) está asociado con varias neoplasias malignas, trastornos neurodegenerativos y es el agente causante de la mononucleosis infecciosa. Una vacuna que prevenga la morbilidad y la mortalidad provocadas por el EBV sigue siendo una necesidad insatisfecha. El EBV se transmite por vía oral e infecta tanto a los linfocitos B como a las células epiteliales. Varias proteínas codificadas viralmente participan en la entrada. El complejo glicoproteico gH/gL es esencial para la infectividad independientemente del tipo de célula, mientras que gp42 es esencial para la infección de las células B. gp350 promueve la unión viral uniéndose a CD21 o CD35 y es la glicoproteína más abundante en el virión. gH/gL, gp42 y gp350 son dianas conocidas de anticuerpos neutralizantes y, por lo tanto, inmunógenos relevantes para el desarrollo de vacunas. Edward’s,et.al., (Vaccines 9,120,2024) desarrollarony optimizaron la administración de varias candidatas a vacunas de RNA replicón (repRNA) derivadas de alfavirus que codifican gH/gL, gH/gL/gp42 o gp350 administradas por un nanoportador catiónico denominado LION™. El candidato principal, que codifica gH/gL de longitud completa, provocó títulos elevados de anticuerpos neutralizantes que persistieron durante al menos 8 meses y una respuesta de células T CD8+ específica de la vacuna. La transferencia de IgG provocada por la vacuna protegió a ratones humanizados de la formación de tumores provocados por el EBV y de la muerte tras una exposición viral a dosis altas. Estos datos demuestran que LION/repRNA-gH/gL es una vacuna candidata ideal para prevenir la infección por EBV y/o enfermedades malignas relacionadas en humanos.
En Detalle
El EBV es un herpesvirus gamma ubicuo. Si bien la infección primaria suele ser asintomática, puede provocar mononucleosis infecciosa. El EBV fue el primer virus que demostró ser oncogénico(causar tumores) en humanos y está asociado con aproximadamente 358.000 nuevos casos de cáncer que resultan en 209.000 muertes cada año. Más allá de su contribución a la carga mundial de cáncer, el EBV se ha relacionado con enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple. Una vacuna exitosa contra el EBV que pueda prevenir la infección y/o reducir la enfermedad sigue siendo una necesidad insatisfecha que reduciría la morbilidad y la mortalidad global relacionadas con estas afecciones.
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Varias vacunas candidatas se encuentran en diversas etapas de desarrollo preclínico y clínico; la mayoría derivan de glicoproteínas de superficie implicadas en la unión y la entrada. El EBV infecta principalmente a los linfocitos B y a las células epiteliales y tiene distintas vías de unión y entrada para cada una de ellas. La maquinaria de fusión viral gH, gL y gB es fundamental para la infección independientemente del tipo de célula. gH y gL forman un complejo heterodimérico 1:1 que actúa como regulador de la fusión de membranas. Al unirse a uno o más receptores de la superficie de la célula huésped, gH/gL transmite una señal desencadenante al fusógeno gB. La infección por EBV de los linfocitos B se inicia mediante la unión a CD21 o CD35 por la proteína viral gp350. La infección de células B requiere una proteína viral adicional, gp42, que forma un complejo tripartito con gH y gL. La unión de gp42 a las moléculas del antígeno leucocitario humano de clase II en la superficie de las células B conduce a la activación de la fusión mediada por gB a través del complejo gH/gL-gp42. El virus que carece de gp350 muestra una infectividad reducida, mientras que la gp42 es esencial para la infección.
En individuos infectados de forma natural, se ha identificado que gH/gL es el objetivo principal de los anticuerpos que previenen la infección de células epiteliales por EBV, mientras que los anticuerpos que neutralizan la infección de células B por EBV se dirigen a gp350, seguido de gH/gL y gp42. Se han aislado múltiples anticuerpos monoclonales neutralizantes (mAb) contra el complejo de glicoproteína gH/gL que puede bloquear la entrada viral tanto en células epiteliales como en células B in vitro. Los detalles de las interacciones entre gH/gL y los receptores de la superficie celular, y los mecanismos moleculares mediante los cuales activa gB, no se conocen bien. En consecuencia, se desconocen los mecanismos por los cuales los mAb neutralizantes contra gH/gL previenen la fusión de membranas. Sin embargo, la transferencia pasiva de mAb gH/gL puede proteger contra la exposición viral en modelos animales de infección por EBV. De manera similar, se han aislado mAb anti-gp42 de primates no humanos (NHP), ratones y conejos que neutralizan la infección de células B por EBV, y se ha demostrado que algunos previenen la infección experimental por EBV en modelos animales. En conjunto, estos hallazgos indican que gH/gL, gp42 y gp350 son fuertes candidatos para el desarrollo de vacunas. Con este fin, Edwardsy colegas y otros han desarrollado nanopartículas de proteínas que muestran EBV gH/gL, gH/gL/gp42 o gp350 que provocan altos títulos de anticuerpos vinculantes y neutralizantes que protegen contra la exposición letal al EBV en ratones con sistemas inmunológicos humanizados.
Como alternativa a las vacunas basadas en proteínas, Edward’s y colegas buscaron aprovechar los avances realizados en la administración basada en ácidos nucleicos para administrar inmunógenos de glicoproteínas del EBV. Se ha utilizado una variante atenuada del virus de la encefalitis equina venezolana, la cepa TC-83, para generar vacunas de RNA replicón autoamplificador (repRNA) en las que el complejo de replicación del RNA viral está intacto, pero los genes estructurales se reemplazan por un gen de interés. La administración de repRNA a las células promueve la síntesis de RNA que codifica antígenos que se autoadyuva al desencadenar respuestas inmunes innatas y promueve el cebado cruzado de antígenos, lo que mejora las respuestas inmunes humorales y celulares en comparación con el mRNA convencional. Se ha demostrado que la administración de repRNA que codifican diversos antígenos virales con un nanoportador catiónico (denominado LION) provoca títulos elevados de anticuerpos, así como respuestas de células T en varios modelos animales preclínicos. Además, esta plataforma ha llevado al desarrollo de una vacuna eficaz contra el SARS-CoV-2 autorizada para uso clínico de emergencia. El repRNA formulado por LION ofrece ventajas significativas sobre otras plataformas de vacunas de RNA, incluida la limitación de la diseminación del RNA al lugar de la inyección, lo que induce inmunidad adaptativa específica del antígeno y al mismo tiempo evita la inflamación sistémica.
Edwards y colegas, evaluaron la capacidad de varios derivados gH/gL, gH/gL/gp42 y gp350 codificados por LION/repRNA para provocar anticuerpos neutralizantes y de unión. Después de la optimización de la construcción y el régimen de dosificación, se evaluó la capacidad de los anticuerpos policlonales para prevenir la infección por EBV en un modelo de ratón humanizado. La transferencia pasiva de anticuerpos provocada por la vacunación con LION/repRNA que codifica gH/gL de longitud completa antes de la exposición a una dosis alta de EBV proporcionó protección contra la letalidad. Los anticuerpos provocados por LION/repRNA también redujeron la carga viral, previnieron la esplenomegalia y evitaron la formación de tumores esplénicos. Por el contrario, los ratones que recibieron IgG provocada por una vacuna de subunidad proteica gH/gL más convencional se volvieron virémicos, desarrollaron tumores esplénicos y, en algunos casos, requirieron eutanasia. Además de provocar respuestas humorales superiores, el repRNA codificado por gH/gL provocó una mayor frecuencia de respuestas de células T CD8+ específicas de la vacuna. En conjunto, estos resultados demuestran que el gH/gL codificado por LION/repRNA es una alternativa atractiva a las vacunas de subunidades recombinantes capaces de provocar títulos elevados de anticuerpos protectores que podrían aumentarse mediante respuestas inmunitarias celulares.
El EBV es un importante oncovirus humano para el que no existe vacuna. Los títulos elevados de anticuerpos neutralizantes contra el complejo de glicoproteína gH/gL protegen contra la infección experimental por EBV en modelos animales, lo que sugiere que provocar estas respuestas será un objetivo importante de una vacuna eficaz contra EBV. Edward y colegas informan el desarrollo y optimización de una vacuna LION/repRNA que codifica el complejo de glicoproteína EBV gH/gL. La optimización incluyó probar la inclusión de gp42 sola o con gp350, el efecto del orden de las dos glicoproteínas gH y gL en construcciones de expresión en tándem, el momento y la dosificación de la administración de repRNA, el efecto del antígeno soluble versus anclado a la membrana, y la administración de gH/gL fusionados a diferentes construcciones multiméricas codificadas por repRNA. Se logró una inmunogenicidad favorable de gH/gL codificada por repRNA cuando el complejo de glicoproteína estaba anclado a la membrana y la dosis más alta de repRNA se administró con 8 semanas de diferencia en un régimen de cebado/refuerzo. Esto dió lugar a títulos elevados de anticuerpos vinculantes y neutralizantes que se mantuvieron hasta 32 semanas después de la inmunización.
gp42 es esencial para la infección por EBV y un objetivo conocido de anticuerpos que neutralizan la infección de células B por EBV. Un estudio previo que comparó la inmunogenicidad de gH/gL con la de gH/gL/gp42 administrado como heterotrímeros monoméricos o nanopartículas basadas en ferritina en ratones encontró que la inclusión de gp42 provocó títulos de neutralización sérica ligeramente más altos contra la infección de células B por EBV y títulos equivalentes. contra la infección de células epiteliales. Los autores observaron lo contrario: títulos neutralizantes equivalentes contra la infección de células B, pero títulos reducidos contra la infección de células epiteliales cuando se administró gp42 conjuntamente con gH/gL en el mismo repRNA. Estas observaciones resaltan las diferencias entre la inmunogenicidad de las nanopartículas de proteínas recombinantes multivalentes, donde los inmunógenos se expresan, purifican y caracterizan ex vivo antes de administrar una dosis fija de antígeno, y el repRNA, que permite una fabricación simplificada, pero la dosis final de antígeno depende de la expresión in vivo. Los títulos de unión reducidos a gH/gL y los títulos de neutralización de células epiteliales más bajos observados con repRNA de gH/gL/gp42 podrían deberse a niveles más bajos de expresión in vivo de gH/gL debido al costo de expresión de incluir gp42. Esta noción está respaldada por la menor intensidad de la tinción de mAb gH/gL en células 293 que expresan gH/gL/gp42 en comparación con gH/gL y títulos de unión más bajos a gH/gL. Además, la inclusión de gp42 puede haber protegido al sistema inmunológico de los epítopos neutralizantes en gH/gL que neutralizan preferentemente la infección por EBV de células epiteliales como CL40. De hecho, se observò una unión más débil de este mAb a gH/gL/gp42 expresado en 293 en comparación con gH/gL solo. Las diferencias en la inmunogenicidad de las dos construcciones de repRNA también podrían explicarse por la competencia inmune que da como resultado títulos más bajos de gH/gL que surgen de una inmunodominancia de gp42.
En línea con otros estudios que evaluaron la inmunogenicidad de nanopartículas proteicas en ratones, la administración conjunta de gp350 junto con gH/gL/gp42 no mejoró los títulos neutralizantes contra la infección por EBV de células epiteliales o células B. Aunque las razones por las que el gH/gL/gp42 codificado por repRNA provocó títulos más bajos de anticuerpos capaces de neutralizar la infección de células epiteliales por EBV no están claras y probablemente sean multifactoriales, la observación de que la inclusión de gp42 y gp350 no mejoró la potencia neutralizante contra La infección por EBV de células B motivó un mayor desarrollo de repRNA que codifica gH/gL solo en nuestro estudio. Se justifican estudios futuros que examinen si la inclusión de gB y/o BMRF2, que también son objetivos de los anticuerpos neutralizantes, puede mejorar aún más la actividad neutralizante del suero.
La administración de LION/repRNA del gH/gL anclado a la membrana de longitud completa o del ectodominio gH/gL soluble provocó títulos de unión de gH/gL similares. Sin embargo, la versión soluble provocó títulos neutralizantes menos potentes contra la infección por EBV tanto de células B como de células epiteliales, lo que demuestra una diferencia cualitativa en la respuesta de anticuerpos a los dos antígenos. Esto fue respaldado aún más por la observación de que los sueros de ratones inmunizados con gH/gL de longitud completa competían más fácilmente por la unión de los mAb neutralizantes descritos previamente. Estas diferencias en las respuestas de los anticuerpos podrían deberse a varias posibilidades no excluyentes. El anclaje de la membrana puede restringir el acceso a epítopos inmunodominantes no neutralizantes que están más expuestos al sistema inmunológico en el ectodominio secretado. De manera similar, el anclaje de la membrana puede conducir a la exposición del epítopo en una matriz repetitiva que es óptima para la participación de los receptores de células B que se dirigen a los epítopos neutralizantes. Aunque los mecanismos precisos que subyacen a las diferencias observadas entre los títulos neutralizantes provocados por gH/gL anclado a la membrana y el ectodominio no están claros, se observó un fenómeno similar al comparar la administración de mRNA de la proteína MERS Spike anclada a la membrana y secretada y que las vacunas contra el SARS-CoV-2 basadas en mRNA se basan en proteínas de espiga de longitud completa en lugar de proteínas de espiga secretadas. En conjunto, estas observaciones subrayan la importancia de evaluar el anclaje de la membrana en la administración de ácido nucleico de los antígenos de la vacuna glicoproteica viral.
Los autores y otros demostraron previamente que la inmunogenicidad de gH/gL recombinante mejoraba sustancialmente mediante la visualización multimérica en nanopartículas autoensambladas. Cuando se administraron mediante repRNA/LION, los gH/gL de 4, 7 y 60 ejemplares fueron menos inmunogénicos que los gH/gL monoméricos unidos a membrana. La antigenicidad reducida probablemente esté relacionada con niveles bajos de expresión, ya que los rendimientos de estos antígenos multiméricos se correlacionaron inversamente con la valencia cuando se expresaron a partir de DÑA plasmídico in vitro. De acuerdo con esta observación, los títulos de unión y neutralización fueron los más bajos en ratones inmunizados con la nanopartícula gH/gL codificada con repRNA de valencia más alta. Como se señaló anteriormente, la expresión de antígenos monoméricos gH/gL anclados a la membrana en la superficie de la célula muy probablemente dio como resultado la presentación de gH/gL como una matriz en la superficie celular, lo que logró efectivamente un efecto de multimerización sin comprometer el nivel de expresión de gH/gL.
Evaluar la eficacia de las vacunas contra el EBV in vivo es difícil ya que el virus tiene un tropismo casi obligado por los humanos, los únicos huéspedes naturales. Se han utilizado ratones NSG injertados con células progenitoras hematopoiéticas CD34+ como modelos de animales pequeños para evaluar la capacidad de los anticuerpos monoclonales o provocados por vacunas para proteger contra la exposición al EBV. Aquí demostraron que la IgG provocada por gH/gL administrada con repRNA fue capaz de prevenir la letalidad por exposición a dosis altas de EBV, reducir la carga viral en la sangre y el bazo, y prevenir tumores esplénicos y esplenomegalia. Esta protección fue superior a la conseguida mediante la transferencia pasiva de IgG provocada por la inmunización con una proteína gH/gL recombinante más convencional administrada con adyuvante. Anteriormente se demostrò que dos inmunizaciones con nanopartículas multiméricas recombinantes de gH/gL provocaron niveles similares de anticuerpos neutralizantes a los que provocaron gH/gL codificado por repRNA (monomérico) y que la transferencia pasiva de la misma cantidad de IgG provocada por nanopartículas de gH/gL también podría lograr un nivel comparable de protección en ratones humanizados. Estos resultados demuestran que la administración de repRNA de gH/gL es una estrategia viable para provocar altos títulos de anticuerpos neutralizantes necesarios para la protección en ratones humanizados que evita los desafíos de expresar y purificar nanopartículas de gH/gL.
La incompetencia inmune de los ratones NSG injertados con huCD34 limita la utilidad de la inmunización directa; sin embargo, la protección brindada por la transferencia o la IgG provocada por repRNA resalta claramente un papel clave de los anticuerpos en la inmunidad anti-EBV. Dado que las células T CD8+ desempeñan un papel fundamental en el control de la infección por EBV en humanos, es lógico que la protección mediada por anticuerpos provocada por repRNA pueda aumentarse mediante respuestas inmunitarias celulares. En este sentido, se observò que el repRNA provocó frecuencias más altas de células T CD8+ productoras de IFNɣ en ratones B6 inmunocompetentes.
Los ratones humanizados no son un modelo perfecto para la infección por EBV, ya que sólo las células B de origen humano soportan la infección y la ruta natural de transmisión oral no es posible. Por lo tanto, los ratones humanizados pueden subestimar la importancia relativa de los anticuerpos capaces de neutralizar la infección de las células epiteliales por EBV. Además, no está claro cómo se compara una dosis intravenosa de virus en ratones humanizados con un inóculo durante una exposición oral natural. La exposición oral de macacos rhesus con el ortólogo del EBV, el linfocriptovirus rhesus (rhLCV), proporciona un modelo de exposición ortogonal para evaluar la inmunogenicidad de las vacunas repRNA; sin embargo, la disparidad antigénica entre EBV y rhLCV puede contradecir la eficacia predictiva de las vacunas EBV en el modelo de macacos rhesus. Sin embargo, más estudios para establecer la inmunogenicidad y la dosificación de LION/repRNA que codifica gH/gL en modelos de animales pequeños adicionales y NHP respaldarán el desarrollo clínico. Aunque en este estudio solo evaluaron la inmunogenicidad en ratones, la plataforma repRNA/LION ha demostrado inmunogenicidad en todas las especies, incluidos ratones, conejos, hámsteres, hurones y NHP para otras vacunas virales. En todos los casos, las vacunas que indujeron respuestas protectoras de anticuerpos en ratones también lo hicieron en todas las demás especies analizadas.
La transferencia pasiva de IgG total provocada por gH/gL monomérico recombinante con menor actividad anti-gH/gL fue menos protectora que la IgG provocada por repRNA en ratones humanizados. Se observó un fenómeno similar al comparar las vacunas gH/gL monoméricas recombinantes con las multiméricas, lo que sugiere que la protección se correlaciona con los títulos neutralizantes. En apoyo de esta idea, la transferencia pasiva de un mAb gH/gL neutralizante protegió contra la exposición oral a rhLCV, siempre que el anticuerpo estuviera presente en niveles adecuados. En conjunto, estas observaciones indican que se requiere un umbral neutralizante para la protección contra la infección por EBV. Esto implica que una vacuna que induzca inmunidad esterilizante necesitará generar anticuerpos duraderos de alto título. Se observò que los títulos de anticuerpos provocados por la administración de repRNA de gH/gL permanecieron estables durante al menos 8 meses después de la inmunización, lo que sugiere que esta plataforma puede ser capaz de conferir inmunidad a largo plazo al EBV. Se justifican estudios de durabilidad ampliada que examinen la longevidad de los títulos y las respuestas subyacentes de las células B específicas del antígeno.
En resumen, los investigadores demostraron que la administración de repRNA/LION de gH/gL provocó altos títulos de anticuerpos neutralizantes que protegieron contra el desafío letal en un modelo de infección en ratón humanizado. Además de provocar anticuerpos neutralizantes duraderos, la administración de repRNA/LION de gH/gL provocó niveles más altos de respuestas de células T CD8+ específicas de la vacuna en comparación con las provocadas por una proteína gH/gL recombinante. La sólida inmunogenicidad de gH/gL codificada por repRNA, la relativa facilidad de fabricación y el perfil favorable de seguridad y reactogenicidad de la plataforma de administración garantizan el desarrollo de vacunas repRNA EBV para ensayos clínicos en humanos.
Ronald Palacios Castrillo