Resumen
Las terapias contra el virus Hepes simplex (VHS )
Sólo son supresoras porque no eliminan el VHS latente presente en las neuronas ganglionares, la fuente de la enfermedad recurrente. Aubert,et.al.,(Nature Communications 15, Número de artículo: 4018 (2024)) han desarrollado un enfoque potencialmente curativo contra la infección por HSV, basado en la edición de genes utilizando meganucleasas específicas de HSV administradas por vectores de virus adenoasociados (AAV).
La edición genética realizada con dos meganucleasas anti-HSV-1 administradas por una combinación de AAV9, AAV-Dj/8 y AAV-Rh10 puede eliminar el 90 % o más del ADN latente del HSV en modelos murinos de infección orofacial, y hasta el 97 % del ADN latente del VHS en modelos murinos de infección genital. Utilizando un enfoque farmacológico para reactivar el HSV-1 latente, los investigadores demuestran que la reducción de la carga viral ganglionar conduce a una disminución significativa de la eliminación viral en ratones hembra tratados.
Si bien la terapia es bien tolerada, en algunos casos observamos hepatotoxicidad en dosis altas y evidencia histológica sutil de lesión neuronal sin signos o déficits neurológicos observables. La simplificación del régimen mediante el uso de un solo serotipo (AAV9) que administra una única meganucleasa dirigida a una región duplicada del genoma del HSV, la reducción de la dosis y el uso de un promotor específico de neurona dan como resultado una mejor tolerabilidad y al mismo tiempo conservan la eficacia. Estos resultados refuerzan el potencial curativo de la edición genética para la enfermedad por HSV.
En Detalle.
Las infecciones por HSV pueden causar lesiones orofaciales, corneales, anogenitales u otras lesiones recurrentes, y las infecciones de los recién nacidos pueden provocar una enfermedad diseminada y secuelas neurológicas devastadoras. La infección genital por HSV-2 aumenta el riesgo de contraer el VIH y es uno de los principales impulsores de la pandemia mundial del VIH. La terapia antiviral actual puede tratar episodios agudos y suprimir los brotes, pero no cura la infección establecida.
Los brotes recurrentes se deben a la capacidad del VHS para establecer una infección latente dentro de las neuronas ganglionares que inervan los sitios afectados. El VHS latente en los ganglios no se ve afectado por los antivirales tradicionales, lo que explica la incapacidad de los antivirales para curar, y las reactivaciones suelen comenzar de nuevo una vez que se suspende el tratamiento.
Una estrategia potencialmente curativa prometedora implica la edición de genes dirigida al propio HSV latente. En un estudio reciente, las meganucleasas administradas por AAV eliminaron más del 90 % de los genomas del HSV-1 de los ganglios cervicales superiores de ratones con infección latente.
A pesar de esta impresionante reducción en las cargas ganglionares de HSV después de la edición genética, la relevancia que dicha reducción tendría para la infección humana por HSV es incierta. Por lo general, a las personas infectadas no les preocupan las cargas virales ganglionares per se, sino la enfermedad sintomática y/o la diseminación viral, y el riesgo asociado de transmisión a otros. Los modelos de ratón existentes tienen una capacidad limitada para abordar estos problemas, ya que los ratones con infección latente rara vez reactivan espontáneamente el VHS o muestran diseminación viral en los tejidos periféricos.
Albert y colegas, presentan un modelo de inducción de moléculas pequeñas de la reactivación del HSV-1 y la eliminación periférica en ratones con infección latente, y demuestran que la edición de genes media una reducción dramática no solo en las cargas virales ganglionares, sino también en la eliminación viral inducida.
La optimización del enfoque terapéutico mediante la simplificación del régimen, la reducción de la dosis y la restricción tisular de la expresión de la meganucleasa da como resultado la eliminación casi completa de los efectos no deseados en el hígado y los ganglios, lo que respalda el desarrollo clínico continuo de esta estrategia.
La infección humana por HSV dura toda la vida y, si bien los enfoques antivirales actuales pueden reducir los síntomas y la transmisión, no curan. Como tal, existe un fuerte deseo insatisfecho de encontrar enfoques nuevos y potencialmente curativos para el HSV. Albert y colegas ahora ampliaron su estudio previo sobre la edición de genes como una posible terapia curativa para el VHS de tres maneras importantes.
Primero, establecieron un modelo de reactivación del VHS en ratones utilizando una molécula pequeña, para mostrar que una reducción de las cargas ganglionares del VHS mediante la edición de genes da como resultado una reducción significativa en la eliminación viral de ratones con infección orofacial establecida.
En segundo lugar, demostraron una alta eficacia de la edición genética del VHS latente en GRD después de una infección genital por VHS. En tercer lugar, redujeron o incluso eliminaron la hepatotoxicidad y la neurotoxicidad detectadas en algunos animales al disminuir la dosis de AAV, simplificar el régimen terapéutico y utilizar un promotor específico del tipo de célula. En conjunto, estos hallazgos abordan varios de los principales impulsores de interés en la cura del HSV y respaldan un mayor desarrollo de la edición de genes para la infección por HSV.
Los ratones se infectan fácilmente con el VHS y han sido fundamentales para definir muchos aspectos de la infección, la latencia y el control inmunológico del VHS. Sin embargo, un inconveniente importante ha sido el hecho de que la infección latente por HSV en ratones muestra una reactivación espontánea o una eliminación periférica del virus mínima o nula. Por lo tanto, los ratones han sido de utilidad limitada en el estudio de terapias o vacunas contra el HSV dirigidas al control de la infección latente y la reactivación.
La reactivación del HSV en ratones puede inducirse mediante diversos estímulos, como la inmunosupresión, el estrés hipertérmico o la irradiación ultravioleta B, pero estos enfoques inducen una eliminación mínima, pueden ser engorrosos y pueden ser aplicables sólo a ciertas cepas específicas de ratón o aislados de HSV.
Aubert y colegas evaluaron la reactivación del HSV mediante inyección intraperitoneal de JQ1, un inhibidor del bromodominio que se ha propuesto como agente reverso de la latencia para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Anteriormente, se informó que JQ1 reactivaba el VHS en modelos de latencia de cultivo celular e inducía la excreción de los ojos de ratones con infección latente, aunque la cantidad y el momento de la excreción no estaban completamente definidos. Aubert y colegas encontraron que JQ1 induce de manera reproducible la diseminación viral detectable en la periferia de un subconjunto sustancial de ratones con infección latente, en niveles cuantitativos (102 a 106 copias/mL) que son similares a los observados en estudios observacionales en humanos.
Estudios adicionales en ratones C57BL/6 infectados de forma latente con HSV-1 mostraron que la eliminación del virus también podría inducirse con la administración de JQ1 , lo que sugiere que la eliminación del virus inducida por JQ1 no se limita a la cepa Swiss Webster. Por lo tanto, el modelo de reactivación JQ1 debería resultar útil para futuros estudios sobre los mecanismos y determinantes de la reactivación y la eliminación periférica del VHS, y las vacunas o terapias destinadas a reducir dicha eliminación.
Entre las personas infectadas por el VHS, una preocupación importante y un motor del deseo de curación es el riesgo de transmisión del virus a otras personas. Si bien su trabajo anterior demostró una reducción de hasta el 90 % del HSV latente dentro de los ganglios después de la edición genética, no estaba claro qué efecto tendría dicha reducción sobre la eliminación viral en la periferia. Utilizando el modelo de reactivación JQ1, los autore encontraron que la reducción de la carga ganglionar mediante la edición de genes tiene un efecto profundo en la eliminación del virus, tanto en términos de la fracción de muestras con virus detectable como también en la cantidad de virus eliminado.
En humanos, la relación entre la cantidad de eliminación del VHS y la probabilidad de transmisión viral aún no se comprende completamente, pero modelos matemáticos previos sugieren que la reducción de la eliminación a niveles por debajo de 104 copias virales (como se observó en la mayoría de nuestros animales tratados que exhibieron eliminación residual) se espera que reduzca en gran medida, si no elimina por completo, el riesgo de transmisión viral.
Un desafío con el modelo de reactivación JQ1 en ratones es la naturaleza estocástica de la reactivación y eliminación viral inducida. Dentro de una cohorte determinada, solo un subconjunto de ratones tratados con JQ1 excretaron HSV detectable, y la excreción en un episodio no predijo la excreción posterior después de repetidas reactivaciones de JQ1.
De manera similar, los ratones individuales a menudo mudan unilateralmente de un solo ojo; Nuevamente, esto no predijo la lateralidad de episodios de muda posteriores. Estos hallazgos son similares a las observaciones en humanos, en quienes la muda es episódica y estocástica, y puede ocurrir en distintos lugares anatómicos durante diferentes episodios de muda. Sin embargo, constituyeron un desafío a la hora de impulsar adecuadamente experimentos diseñados para detectar una reducción en la eliminación viral.
Si bien cada uno de los experimentos individuales demostró una tendencia similar hacia la reducción de la eliminación del VHS después de la terapia con AAV/meganucleasa, muchos experimentos individuales no alcanzaron significación estadística. Esto fue particularmente evidente después de la infección genital por HSV, donde la menor carga viral latente en los GRD pareció dar como resultado tasas de reactivación más bajas después de la administración de JQ1.
La optimización del modelo de infección genital para aumentar las cargas de GRD latentes puede facilitar una evaluación adicional del efecto de la edición de genes en la eliminación de virus, aunque en nuestra experiencia los esfuerzos para aumentar las cargas virales latentes deben equilibrarse cuidadosamente con el aumento de la mortalidad animal durante la fase aguda de la infección.
En cualquier caso, el metanálisis de los datos combinados de todos nuestros experimentos confirmó una reducción muy significativa en la eliminación del VHS de los animales tratados con AAV/meganucleasa en comparación con los controles. Esta reducción en la excreción resultó depender tanto de la dosis como de la duración del tratamiento. Esta última observación es particularmente alentadora con respecto a la posible traducción clínica del trabajo.
Aquí, se evaluó la carga ganglionar y la eliminación de los ratones aproximadamente un mes después de la administración de AAV/meganucleasa, pero los datos sugieren que la eficacia de la edición del gen HSV probablemente continúa más allá de este punto, lo que puede conducir a una reducción o eliminación más completa de la eliminación viral en momentos posteriores. Actualmente se están realizando experimentos para evaluar la edición del gen HSV en ratones durante períodos de un año o más, y para determinar si la eficacia general finalmente se estabiliza.
Un segundo hallazgo importante en estos estudios es que las meganucleasas administradas por AAV pueden ingresar fácilmente a las neuronas y editar el HSV dentro del DRG, el sitio de latencia del HSV en la enfermedad genital. Se ha observado consistentemente una reducción superior de la carga viral del VHS en los SCG (que son ganglios autónomos; típicamente una reducción de ~90%) en comparación con los TG (ganglios sensoriales; típicamente una reducción de ~50-60%).
Esto planteó la posibilidad de que los DRG (también ganglios sensoriales) también pudieran mostrar tasas modestas similares de reducción del genoma. Sin embargo, la edición de genes de genomas latentes de HSV demostró ser altamente eficiente dentro de DRG (reducción del 97%), lo que sugiere que las diferentes eficiencias no son intrínsecas al tipo de ganglio (sensorial versus autónomo).
Actualmente se favorece la hipótesis de que las eficiencias relativas de la transducción de AAV en los distintos ganglios están impulsadas principalmente por la permeabilidad relativa de la barrera sanguínea/ganglionar para cada tipo de ganglio, y tenemos una serie de experimentos en marcha para abordar este problema.
Una limitación de nuestro trabajo es que las secuencias objetivo de HSV-1 de las meganucleasas utilizadas en este estudio no están bien conservadas en HSV-2. Por lo tanto, se realizaron experimentos de infección vaginal utilizando HSV-1, para dejar claro que no parece haber ninguna barrera para el tratamiento de enfermedades genitales versus orofaciales; es decir, las neuronas infectadas de forma latente en ambos sitios son fácilmente accesibles para los vectores de AAV, así como para la edición de genomas de HSV latentes mediada por meganucleasas. Cabe señalar que el tratamiento exitoso de la infección genital por HSV-1 no es un resultado trivial: más de la mitad de los nuevos casos de herpes genital en los EE. UU. se deben ahora al HSV-1.
Sin embargo, hay que reconocer plenamente la importancia del HSV-2 como objetivo, y el trabajo actual en nuestro laboratorio se centra en el desarrollo de meganucleasas anti-HSV-2 y sus pruebas en ratones y otros modelos de infección. Hay especial interés en apuntar a regiones duplicadas de HSV-2, que según los resultados permitirán una terapia eficaz con una sola nucleasa, y se podría pensar que se consideren sitios duplicados o repetidos para los esfuerzos de edición de genes dirigidos a otros virus.
Los vectores AAV generalmente se han considerado seguros, particularmente en comparación con otros vectores de terapia génica. Sin embargo, en dosis altas, los vectores AAV pueden inducir toxicidad hepática, que se manifiesta inicialmente como una elevación de las transaminasas. Con dosis de AAV superiores a las utilizadas en los experimentos presentados aquí, la toxicidad hepática puede ser grave y ha provocado insuficiencia hepática en varios modelos animales.
Por lo tanto, fué alentador observar una fuerte actividad anti-HSV en dosis de AAV que fueron bien toleradas en el modelo de ratón usado en este estudio. Más recientemente, se ha descrito evidencia histológica de lesión neuronal después de la administración de AAV en ratones, ratas, lechones, perros y primates no humanos, y en al menos dos participantes en ensayos humanos en la autopsia.
El mecanismo causante de dicha lesión aún no está claro; entre las principales hipótesis actuales se encuentran la saturación de la capacidad de plegamiento de proteínas neurales y el reconocimiento de RNA del vector vector o transgén mediado por TLR9. A pesar de la evidencia histológica de lesión neuronal, los signos clínicos en animales de experimentación han sido raros y consisten principalmente en una leve alteración de la marcha o del equilibrio.
Estos signos sólo se han informado en un solo paciente entre varios miles de participantes humanos en ensayos de terapias génicas administradas con AAV. De acuerdo con estos otros estudios, los autores encontraron evidencia sutil de lesión neuronal en ratones experimentales, que se manifiesta como degeneración neuronal, necrosis y axonopatía, pero los ratones no han mostrado ninguna alteración de comportamiento asociada.
Los resultados obtenidos utilizando un promotor neuronal específico para impulsar la expresión de meganucleasa fueron algo sorprendentes, ya que muestran una ausencia de toxicidad neuronal fácilmente detectada con el uso de un promotor ubicuo. Si bien no son definitivos en sí mismos, estos resultados respaldan la consideración de una hipótesis alternativa, que la neurotoxicidad ganglionar está mediada indirectamente a través de los efectos del AAV en células no neuronales, en lugar de en las neuronas mismas.
En cualquier caso, los datos con la simplificación del régimen, la reducción de la dosis y la restricción tisular de la expresión transgénica son tranquilizadores de que se pueden diseñar vías de mitigación para eliminar tanto la hepatotoxicidad como la neurotoxicidad. Por lo tanto, son importantes estudios adicionales en modelos animales alternativos de infección por HSV, como cobayas o incluso primates no humanos, y si dichos estudios confirman la eficacia anti-HSV con un perfil de seguridad aceptable, pueden estar justificados los ensayos en humanos.
Esto está respaldado por el informe reciente sobre el uso de una estrategia de edición de genes para eliminar el VHS de humanos en un ensayo intervencionista no aleatorizado, abierto, de un solo brazo y iniciado por un investigador en 3 pacientes con queratitis estromal herpética refractaria grave (HSK ). En este estudio, no se detectaron escisiones fuera del objetivo ni eventos adversos sistémicos en los 18 meses de seguimiento, mientras se previno la recaída viral.
Ronald Palacios Castrillo