Ronald Palacios Castrillo, M.D.,PhD.
Una herramienta de edición del genoma recientemente patentada, llamada PASTE, es una verdadera promesa para expandir el universo de enfermedades genéticas tratables. El enfoque combina elementos de CRISPR y edición principal con un par de enzimas diseñadas para permitir la integración de grandes segmentos de DNA sin incurrir en roturas de DNA de doble cadena.
La patente estadounidense n.º 11.572.556, cedida al MIT, cubre sistemas, métodos y composiciones para la adición programable a través de elementos de orientación específicos del sitio (PASTE). La patente describe la integración específica del sitio de un ácido nucleico en un genoma, utilizando una nickasa CRISPR-Cas9 fusionada con una transcriptasa inversa (RT) y una serina integrasa.
Estas enzimas se dirigen a secuencias genómicas específicas conocidas como sitios de unión, uniéndose a ellas antes de integrar su carga útil de DNA.
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PASTE puede insertar fragmentos de DNA de hasta
50.000 pares de bases, lo que lo coloca en un plano diferente en comparación con otras herramientas de edición del genoma, como la edición principal.
Los inventores acreditados son Omar Abudayyeh, PhD, y Jonathan Gootenberg, PhD, dos becarios McGovern en el Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro del MIT. El dúo, que eran estudiantes graduados con el pionero de CRISPR Feng Zhang, PhD, en el Instituto Broad, reportó por primera vez PASTE en una preimpresión publicada en bioRxiv en 2021.
El artículo revisado por pares, » Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases”, se publicó en noviembre de 2022 en Nature Biotechnology.
PASTE implica la ingeniería de Cas9, RT y enlazadores de integrasa para crear una proteína de fusión capaz de integración eficiente (5-50 %) de diversas cargas en ubicaciones objetivo definidas con precisión dentro del genoma humano con pequeñas cicatrices estereotipadas que pueden servir como enlazadores de proteínas .
Las serina integrasas utilizadas en PASTE pueden insertar secuencias de DNA de hasta 50.000 pares de bases al dirigirse a sitios de «unión» específicos dentro del genoma.
Ha sido muy difícil para el campo [CRISPR] realizar grandes ediciones en el genoma sin depender de cosas como la reparación dirigida por homología.
El concepto de PASTE en realidad es bastante simple: en lugar de poder intentar hacer todo a la vez en un aspecto conceptual, y hay algunas tecnologías que se acercan a eso, los autores pensaron que sería más fácil tomar algo que pueda insertarse de manera muy eficiente, en una secuencia constante como una integrasa, y luego poner la secuencia constante en el genoma.
Es un proceso de dos pasos en el que primero se inserta la secuencia constante, que es una letra minúscula, y es más fácil de hacer. Luego se usa esa secuencia constante para poner una secuencia más grande. Ese es el concepto en pocas palabras simples.
PASTE y prime se encuentran entre numerosas tecnologías que se han desarrollado en el campo emergente de la edición del genoma a medida que los investigadores y las nuevas empresas buscan terapias curativas que realizan cambios en el genoma sin hacer rupturas de doble cadena, una desventaja conocida de la edición tradicional de genes CRISPR-Cas9 que puede ser perjudicial. a las células.
El uso de PASTE podría potencialmente tratar enfermedades causadas por genes que albergan una gran cantidad de mutaciones, como la amaurosis congénita de Leber o la fibrosis quística, donde los sistemas de edición de genes tendrían que adaptarse para mutaciones específicas y cada subconjunto de una población de enfermedades.
En esas enfermedades, la inserción programable de un gene de tipo nativo podría abordar la mayoría de las mutaciones potenciales y servir como terapia general.
Se puede contemplar el reemplazo completo de los genes en sus sitios naturales en lugar de crear tratamientos específicos de variantes.
Estos emocionantes resultados mejoran la versatilidad de la edición de genes basada en CRISPR junto con las LSR [serina recombinasas grandes] que brindan la oportunidad para la ingeniería genómica, la detección combinatoria de bibliotecas de DNA voluminosas que ayudan a difundir estas aplicaciones para tratar enfermedades tanto en humanos como en otros animales y plantas, que son causadas por genes defectuosos.
La realización de la edición del genoma sin la necesidad de roturas de doble cadena en el DNA fue planteada por primera vez por David Liu, PhD, y sus colegas del Instituto Broad del MIT y Harvard.
En un par de artículos en Nature publicados entre 2015 y 2016, el laboratorio de Liu desarrolló la edición de base, una técnica que puede hacer ciertas clases de sustituciones de base única sin dividir la doble hélice (a diferencia de CRISPR-).
Más tarde, en un artículo de 2019 publicado en Nature, Andrew Anzalone y sus colegas, en el laboratorio de Liu describieron una tecnología de edición del genoma de «búsqueda y reemplazo» llamada edición principal.
Ese enfoque proporcionó una edición deseada en una extensión del RNA guía, que luego se convierte en DNA usando la enzima RT. La tecnología puede introducir inserciones, eliminaciones y las 12 posibles sustituciones de base a base.
Liu señaló ,que de las aproximadamente 75.000 mutaciones patógenas catalogadas en enfermedades genéticas humanas, la edición principal tenía la versatilidad y el potencial para corregir la mayoría (89 %) de ellas.
El artículo de Liu de 2019 mostró que la edición principal se usaba para instalar un sitio de aterrizaje de integrasa/recombinasa en un sitio de DNA objetivo.
Anteriormente, en marzo de ese año, Liu y sus colegas solicitaron una patente de EE.UU. que se otorgó en septiembre de 2022 (n.º 11 447 770), que describía varios ejemplos que usaban edición principal para instalar sitios de aterrizaje de integrasa/recombinasa, seguidos de integración de genes específicos usando un enzima integrasa/recombinasa.
Y en un artículo de 2021 publicado en Nature Biotechnology, Liu y los coautores informaron el uso de la edición principal para instalar un sitio de aterrizaje de integrasa/recombinasa en un sitio de DNA objetivo, seguido de una integrasa/recombinasa para catalizar la integración del DNA de carga en ese sitio de aterrizaje.
Prime vs PASTE
Liu afirmó que una distinción entre PASTE y el enfoque PASSIGE™ (edición de genes de integrasa específica del sitio asistida por prime) de Prime es que PASTE fusiona el editor principal y la enzima integrasa en una sola cadena de proteína, mientras que PASSIGE generalmente los usa como dos proteínas separadas.
Hemos comparado, uno al lado del otro, editores principales fusionados y no fusionados más integrasas en varios sitios objetivo diferentes en células humanas, y nunca hemos observado ningún beneficio al fusionar el editor principal y la integrasa ,apuntó Liu.
De hecho, para la mayoría de los sitios objetivo y las combinaciones de enzimas integrasas que hemos probado en células humanas, observamos que las proteínas fusionadas del editor principal y la integrasa, como se informó en el documento PASTE, tienen un rendimiento sustancialmente inferior al del editor principal y las proteínas integrasas separadas que se usan en PASSIGE, dijo Liu.
Que el editor principal separado + las proteínas integrasas funcionen mejor que fusionar las dos proteínas juntas tiene sentido científicamente, porque el editor principal debe abandonar el sitio de destino antes de que la enzima integrasa pueda realizar la integración del DNA de carga.
Liu arguye que fusionar las dos proteínas aumenta la posibilidad de que el sitio de aterrizaje objetivo sea bloqueado por la proteína de edición principal y/o el RNA guía de edición principal asociado (pegRNA), porque la integrasa debe competir con un editor principal siempre cercano para acceder al sitio de aterrizaje objetivo cuando las dos proteínas están atadas.
Por el contrario, fusionar la proteína Cas que corta el DNA y la transcriptasa inversa diseñada en una proteína editora principal tiene sentido porque la proteína Cas debe mantener abiertas, o fundir, las dos cadenas de DNA para que la cadena de DNA objetivo cortada inicie la transcripción inversa, iniciando el proceso de edición principal.
En este caso, la fusión de Cas nickase con la transcriptasa inversa diseñada ofrece un beneficio porque mantiene cerca a la transcriptasa inversa diseñada, preparada para actuar en el sitio de DNA objetivo abierto y cortado.
En otras palabras, las dos proteínas, en este caso, actúan juntas, mientras que en el caso de PASSIGE/PASTE, las dos proteínas deben actuar por separado.
Buscar y reemplazar
En Prime sus editores pueden cambiar cualquier nucleótido a cualquier otra base, eliminar secuencias de DNA para corregir mutaciones de inserción o insertar secuencias de DNA para corregir mutaciones de eliminación. Los editores principales también pueden alterar las regiones reguladoras de los genes, insertar o crear STOP codones de parada prematuros y modificar las secuencias de empalme.
Prime acaba de anunciar la selección de su primer candidato de desarrollo: PM359, un tratamiento para la enfermedad granulomatosa crónica, después de observar el injerto in vivo a largo plazo de células madre hematopoiéticas (HSC) editadas con Prime en un modelo de la enfermedad en el ratón.
En enero pasado, Prime anunció datos preclínicos positivos para tres de sus programas de desarrollo: candidatos para tratar la ataxia de Friedrich, la fibrosis quística y la enfermedad de Wilson.
Además, Prime anunció que su plataforma PASSIGE logró una inserción precisa de aproximadamente el 60 % de un transgéne de interés de 3,5 kilobases en un único sitio target en las células T humanas primarias, lo que resultó en una expresión positiva del producto génico.
En el estudio PASTE publicado el año pasado, Abuddayeh, Gootenberg y un equipo de más de dos docenas de coautores detallaron cómo administraron genes que oscilaban entre 779 y 36.000 pares de bases nucleicas, un rango que permitiría la inserción de >99,7 % de DNAc humano como transgenes: a tres líneas celulares humanas, células T humanas primarias y células hepáticas, así como a células hepáticas en ratones.
En todas las células humanas estudiadas, los investigadores pudieron insertar genes con tasas de éxito que oscilaron entre el 5 y el 60 %, con una formación «mínima» de “cicatrices” en los sitios de integración. Los investigadores probaron el sistema de entrega con 13 genes de carga útil, incluidos algunos que podrían ser útiles desde el punto de vista terapéutico, y pudieron insertarlos en nueve ubicaciones diferentes del genoma.
Los investigadores también informaron la inserción de genes en hígados «humanizados» en ratones, que consisten en aproximadamente un 70 % de hepatocitos humanos; PASTE mostró un porcentaje mucho más bajo (hasta un 2,5 %) de integración exitosa de nuevos genes, con una inserción promedio que oscilaba entre el 0,3 % o 1,4%.