Esta es una revisiòn actual de la evoluciòn de la biologia molecular por uno de sus fundadores y gran contribuyente, el Prof. Tom Maniatis. Lo que sigue es la traducciòn y ediciòn de este excelente artículo para facilitar su lectura y comprensiòn.
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Resumen
La tecnología del ADN recombinante ha avanzado profundamente en prácticamente todos los aspectos de las ciencias biológicas y médicas, desde la investigación básica hasta la biotecnología. En este artículo, el Prof. Tom Maniatis analiza las conexiones conceptuales que vinculan los descubrimientos fundamentales que fueron posibles gracias a la tecnología, los avances en la comprensión de la regulación genética tanto en procariotas como en eucariotas, y la reciente terapia génica basada en CRISPR aprobada por la FDA para la anemia de células falciformes y la β-talasemia basada en la desrepresión transcripcional.
Texto principal
Me invitaron a escribir un breve comentario sobre los primeros días de la investigación del ADN recombinante para el 50 aniversario de la revista Cell. Mi primer «artículo en Cell» se publicó hace 49 años, y trabajé en el consejo editorial de Cell durante gran parte de mi carrera. Este artículo no pretende ser un relato académico y, debido a las severas limitaciones de palabras y referencias, no pude hacer referencia al trabajo de muchos otros que hicieron contribuciones fundamentales a los avances que describo brevemente. Con la reciente aprobación del fármaco basado en CRISPR para el tratamiento de la anemia de células falciformes y la β-talasemia, me sorprendió el continuo conceptual desde la genética microbiana temprana hasta el estado actual de la genética y la genómica eucariotas. Los principios básicos del código genético y la biología molecular de los procariotas se establecieron en los años transcurridos entre el descubrimiento de la estructura del ADN en 1953 y el surgimiento de la investigación del ADN recombinante en 1973, como lo documentó con extraordinario detalle en 1979 Horace Freeland Judson en el “Octavo día de la creación” y se celebró el año pasado en un simposio de Cold Spring Harbor sobre “ADN recombinante: cincuenta años de descubrimientos y debates”. Los rápidos avances en la investigación del ADN recombinante fueron posibles gracias a décadas anteriores de investigación en genética microbiana. Los mapas genéticos detallados de bacterias y bacteriófagos proporcionaron el marco conceptual para diseñar vectores de clonación, estrategias para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética y las herramientas y el conocimiento biológico que hicieron posible el desarrollo de métodos de ADN recombinante. Al mismo tiempo, los avances en la purificación de proteínas y la enzimología proporcionaron una serie de enzimas que actúan sobre los ácidos nucleicos, incluidas las polimerasas de ARN y ADN, la quinasa y la ligasa de ADN, las enzimas de restricción, la transcriptasa inversa, las polimerasas de ARN, la transferasa terminal y más. Así, los avances combinados en genética molecular y enzimología desempeñaron un papel decisivo en el establecimiento de la investigación del ADN recombinante y los avances posteriores en genética molecular eucariota.
Regulación génica en procariotas
Con la llegada de la investigación sobre el ADN recombinante en 1974, resultó de especial interés el potencial de estudiar los mecanismos moleculares de la regulación génica en eucariotas. Antes de esa fecha, los estudios sobre la regulación génica eran un foco central de la investigación microbiana. Entre los avances más significativos se encontraba la teoría del operón de la regulación génica, de François Jacob y Jacque Monod en 1961. La teoría se basaba en estudios genéticos y bioquímicos de la regulación del metabolismo de la lactosa en E. coli y en el trabajo de Andre Lwoff sobre el mecanismo de la lisogenia del bacteriófago λ. Según la teoría del operón, las moléculas difusibles (represores) se unen a secuencias reguladoras del ADN (operadores) en el ADN bacteriano o fágico y “reprimen” la expresión génica. Los genes se “activan” mediante la combinación de la desrepresión y la unión de la ARN polimerasa a “promotores”, que se superponen a los operadores. Este avance conceptual, basado en una genética procariota brillante y una intuición extraordinaria, fue reconocido con el Premio Nobel a Jacob, Monod y Lwoff en 1965. Sin embargo, el modelo requería una prueba bioquímica directa.
Sorprendentemente, solo un año después, Walter Gilbert y Benno Mueller-Hill aislaron el “represor Lac” y Mark Ptashne purificaron el “represor lambda (λ)” del bacteriófago, lo que proporcionó la prueba bioquímica de la teoría del operón. Se demostró que tanto los represores Lac como los λ eran proteínas (en lugar de los ARN propuestos originalmente) que se unen específicamente al ADN operador y reprimen la transcripción del ARN al impedir la unión de la ARN polimerasa. Estos inicios propicios, en combinación con extraordinarios estudios bioquímicos, genéticos y de biología estructural durante las décadas siguientes, revelaron los mecanismos fundamentales de la regulación génica procariota, que se convirtieron en la piedra angular de nuestra comprensión de los principios que rigen la regulación génica desde las bacterias hasta los humanos. Secuenciación de ADN de promotores/operadores λ bacterianos y bacteriófagos
Un paso clave para comprender los mecanismos moleculares de la regulación génica en bacterias fue la determinación de la secuencia de ADN de los ADN operadores. Esto, a su vez, condujo a la comprensión de cómo las proteínas reguladoras, como los represores y la ARN polimerasa, reconocen y se unen a secuencias de ADN específicas y los mecanismos moleculares que subyacen a la activación y represión transcripcional. En 1971, me uní al laboratorio de Mark Ptashne en Harvard Biolabs como becario postdoctoral con el objetivo de aislar y caracterizar los operadores λ de bacteriófagos utilizando proteína represora λ purificada. Descubrimos que los operadores λ tienen múltiples sitios de unión de represores, que más tarde se demostró que eran críticos para la orquestación del complejo cambio genético de lisogenia a propagación lítica del virus. Al mismo tiempo, Walter Gilbert y Alan Maxam, vecinos en Harvard Biolabs, aislaron el operador Lac, que tiene un solo sitio de unión de represor. La secuencia de ADN del operador Lac se determinó mediante la transcripción del ADN purificado del operador y la secuenciación del ARN. En 1973, Mark y yo visitamos el laboratorio de Fred Sanger en el Laboratorio de Biología Molecular del MRC en Cambridge, Inglaterra, para intentar la secuenciación directa del ADN de los operadores λ. En ese momento (cuatro años antes del desarrollo de los métodos de secuenciación de ADN de Sanger y Maxam-Gilbert), se utilizaban métodos de secuenciación de ADN relativamente primitivos en el laboratorio de Sanger. Se necesitó casi un año para determinar la secuencia de ADN de solo 27 pares de bases de los 100 pares de bases de uno de los dos operadores en 1974. Sin embargo, la secuencia completa de ADN de los operadores de derecha e izquierda se completó en 1975[1]. Las secuencias de ADN de los operadores Lac y λ y las regiones promotoras, junto con los operadores mutantes que presentan mutaciones en los sitios de unión de la ARN polimerasa y del represor, proporcionaron la primera descripción genética y molecular detallada de las secuencias de ADN reguladoras que «actuaban en cis». En los años siguientes, el laboratorio de Ptashne combinó elegantes enfoques genéticos, bioquímicos y de biología estructural para revelar los mecanismos moleculares detallados del “interruptor genético” lambda, que ha servido como paradigma para comprender los mecanismos fundamentales de la regulación genética tanto en procariotas como en eucariotas[2].
ADN recombinante
Al regresar a Harvard desde el MRC, Argiris Efstratiadis, un médico que cursaba un doctorado en el laboratorio de Fotis Kafato, me contactó para colaborar en un esfuerzo por generar transcripciones de ADNc de longitud completa para estudios de hibridación de ARN, lo que dio paso a un esfuerzo por generar y clonar ADNc de β-globina bicatenario de longitud completa. Logramos establecer las condiciones para generar transcripciones de ADNc de β-globina de conejo de longitud completa aproximadamente al mismo tiempo que el laboratorio de Hogness publicó la clonación de fragmentos aleatorios de ADN de Drosophila utilizando poli dA:dT para unir los fragmentos de ADN a un vector de clonación de plásmido. Por lo tanto, iniciamos los esfuerzos para generar y clonar un ADNc de globina bicatenario de longitud completa. Maxam y Gilbert estaban en las etapas finales del desarrollo de su método de secuenciación de ADN, por lo que determinamos la secuencia de ADN del ADNc de doble cadena de longitud completa, que proporcionó la primera secuencia completa de un ARNm eucariota[3].
El clon de ADNc de β-globina bien caracterizado se puso a disposición de todos y se utilizó en estudios de “transferencia Southern” para crear mapas de restricción del grupo de genes de β-globina humana y para identificar intrones en el gen de β-globina de conejo en el laboratorio de Richard Flavell. Shirley Tilghman y otros en el laboratorio de Phil Leder fueron los primeros en clonar un gen de mamífero, el gen de β-globina de ratón[4]. Utilizaron un método de prepurificación de varios pasos del ADN genómico de ratón mediante cromatografía en columna y electroforesis en gel preparativa. El paso final fue clonar el ADN genómico de ratón parcialmente purificado utilizando un vector de clonación de bacteriófago λ y examinar las placas de fagos con ADNc de β-globina marcado con 32P. El análisis del ADN clonado reveló la presencia de intrones.
Clonación de genes y regulación génica eucariota
Antes de la aparición de la tecnología del ADN recombinante, la posibilidad de lograr una comprensión mecanicista de la regulación génica en eucariotas, y particularmente en humanos, parecía una meta lejana. El primer paso para lograr ese objetivo fue aislar los genes y sus secuencias de ADN reguladoras, y los genes de la globina similar a la β de los mamíferos eran una opción obvia para la clonación génica. En 1977, mi laboratorio (entonces en Caltech) estableció un enfoque más generalizado para la clonación génica eucariota, que eliminó la necesidad de purificación del ADN: la generación y selección de bibliotecas de ADN genómico de mamíferos. El concepto de biblioteca (también conocido como “clonación shotgun”) fue introducido por primera vez por Hogness para aislar fragmentos aleatorios de ADN genómico y mapear los cromosomas específicos de Drosophila mediante hibridación in situ con cromosomas politénicos[5]. Posteriormente, Clarke y Carbon formalizaron el concepto al determinar la cantidad de clones de ADN genómico independientes generados aleatoriamente necesarios para generar cantidades adecuadas de plásmidos recombinantes o fagos necesarios para asegurar la presencia de cada gen en un genoma en la biblioteca[6]. Usando esta estrategia, se construyeron y caracterizaron bibliotecas de ADN genómico completamente “representativas” para ADN genómico de Drosophila, conejo y humano[7]. La ventaja de este enfoque es que la biblioteca podría compartirse y usarse para aislar cualquier gen para el cual estuviera disponible una sonda de hibridación de ADNc clonada específica. Clonamos todos los grupos de genes humanos de β- y α-globina[8]. Se encontró que ambos grupos de genes estaban organizados en el orden de su expresión durante el desarrollo (ver la revisión en Maniatis et al.9). Los esfuerzos simultáneos de los laboratorios de Oliver Smithies y Fred Blattner lograron aislar fragmentos de los genes de la γ-globina humana a partir de bibliotecas de ADN genómico del bacteriófago λ. El concepto de biblioteca fue más tarde fundamental para el Proyecto Genoma Humano, donde se implementaron vectores de clonación de cósmidos capaces de albergar entre 30 y 45 KB de ADN genómico, lo que hizo posible «recorrer el genoma» para aislar y secuenciar clones superpuestos de ADN genómico.
Introducción de genes clonados en cultivos de células de mamíferos
El estudio del impacto de las mutaciones cis en la expresión génica in vivo en bacterias permitió comprender los mecanismos moleculares de regulación génica en procariotas. Para estudiar los mecanismos de regulación génica en eucariotas fue necesario aplicar métodos equivalentes. En 1978, Michael Wigler, Saul Silverstein y Richard Axel aportaron una solución al informar sobre la introducción estable de genes en células de mamíferos en cultivo mediante la “transformación” del ADN[10,11]. El momento de este avance fue afortunado: el mismo año en que se clonó el gen de la β-globina humana, Richard Axel, un amigo cercano y colega, estaba visitando mi laboratorio en Caltech en un “mini-año sabático”, y discutimos el potencial de introducir el gen de la β-globina humana clonada en células en cultivo, inicialmente en fibroblastos de ratón y posteriormente en células eritroides de ratón y humanas utilizando el método de cotransformación[12]. Así, sólo 5 años después de la primera demostración del ADN recombinante, se hizo posible estudiar la transcripción de genes de globina clonados en líneas de células eritroides en cultivo. Al mismo tiempo, la cotransformación, junto con la capacidad de amplificar el número de copias de genes clonados en células de mamíferos en cultivo, hizo posible la expresión de altos niveles de proteínas terapéuticas recombinantes (como factores de coagulación sanguínea, eritropoietina y proteínas morfogénicas óseas), el foco de la biotecnología temprana (véase Harris, 2024(13).
Los estudios de la transcripción del gen de la β-globina clonado en un vector del virus tumoral SV40 condujeron al descubrimiento de un elemento potenciador de la transcripción por Julian Banerji y Walter Schaffner. Posteriormente, los potenciadores de la transcripción se identificaron como elementos reguladores esenciales en el ADN genómico de los mamíferos[14]. Los sistemas verdaderamente in vivo para estudiar la regulación génica eucariota se proporcionaron más tarde mediante el desarrollo de métodos para introducir genes clonados en el genoma del ratón.
Estructura de la cromatina, regiones de control de locus, bucles de ADN y conmutación de hemoglobina
La accesibilidad de los glóbulos rojos y sus precursores del desarrollo hicieron que el grupo de genes de la β-globina humana fuera un sistema ideal para estudiar la regulación génica durante el desarrollo. La activación y represión secuencial de los genes de globina embrionaria (épsilon [ε]) y fetal (gamma [γ]) y el cambio a la expresión de globina beta (β) adulta proporcionaron un sistema ideal para estudiar los mecanismos moleculares de la regulación génica del desarrollo. La introducción de genes de globina humana en líneas celulares eritroides en cultivo y en ratones transgénicos reveló el papel de factores de transcripción específicos, promotores, potenciadores y bucles de ADN en la regulación de la expresión génica de globina durante el desarrollo. Se identificaron múltiples factores de transcripción y represores. Ahora sabemos que este mecanismo de cambio está coreografiado a nivel de la dinámica de la cromatina a través de bucles de ADN secuenciales entre un «superpotenciador» de globina y los promotores de los genes de globina embrionaria, fetal y adulta.
Terapia génica con globina
Como demostró por primera vez Linus Pauling en 1950, una mutación en el gen de la β-globina adulta altera la estructura de la hemoglobina, lo que da lugar a glóbulos rojos en forma de medialuna o de hoz con una flexibilidad reducida, lo que a su vez provoca un bloqueo doloroso de las arterias pequeñas y una falta de oxígeno. La β-talasemia es causada por niveles bajos de producción de β-globina adulta o por la expresión de una proteína β-globina no funcional, lo que en ambos casos produce una deficiencia de oxígeno. Cabe destacar que ambas enfermedades genéticas se ven mitigadas por la condición genética Persistencia Hereditaria de la Hemoglobina Fetal (HPFH), en la que no se produce el cambio programado durante el desarrollo de la producción de γ-globina fetal a β-globina adulta. La ausencia de la β-globina adulta defectuosa y la presencia de γ-globina normal en los adultos disminuyen drásticamente las consecuencias patológicas. Por lo tanto, un objetivo central de la terapia génica ha sido suprimir el cambio de la expresión génica de la γ-globina a la β-globina. La hidroxiurea, que aumenta el nivel de γ-globina en adultos, se utiliza ampliamente, pero tiene una ventana terapéutica/tóxica estrecha, lo que impulsa la búsqueda de un medio más eficaz para regular el cambio en la expresión génica de la globina.
Desde el principio, la reunión anual “Hemoglobin Switching” de la década de 1970, inicialmente organizada por George Stamatoyanopoulis, David Nathan y David Weatherall, jugó un papel fundamental en el avance de la investigación sobre la globina. Médicos, hematólogos, biólogos moleculares y celulares, científicos de células madre y más se reúnen regularmente en Seattle y otros lugares para presentar y discutir los últimos avances en la investigación sobre la globina. Esta reunión ha jugado (y sigue jugando) un papel crítico en el avance de la investigación básica y traslacional sobre la globina.
El papel de secuencias de ADN genómico no codificantes específicas en la regulación de la hemoglobina
El avance de las tecnologías genómicas y los estudios del mecanismo de acción de las variantes de la secuencia de ADN que se asocian con la expresión persistente de γ-globina en adultos proporcionaron información clave sobre el mecanismo de la progresión del desarrollo de la regulación del gen de la globina. En 2009, los estudios de asociación de todo el genoma (GWAS, por sus siglas en inglés) de pacientes con HPFH en Cerdeña proporcionaron una pista fundamental, que reveló variantes de la secuencia de ADN no codificantes que se asocian con mayores niveles de γ-globina en adultos con anemia de células falciformes. Los estudios de seguimiento realizados por Stuart Orkin, Vijay Sankaran y colaboradores revelaron que las variantes de GWAS se asignan a un elemento potenciador de la transcripción necesario para la expresión del represor de la transcripción BCL11A en las células eritroides (consulte Zheng et al.[15] para una revisión completa reciente y referencias). Se demostró que BCL11A se une a un motivo de secuencia de ADN que se encuentra en los promotores de los genes de la ε y la γ-globina. Por lo tanto, una reducción en la producción del represor BCL11A o mutaciones en los «operadores» del gen de la γ-globina dan como resultado la producción de altos niveles de γ-globina en adultos. Entonces surgió una nueva estrategia para las terapias génicas de la globina: imitar el HPFH natural mediante la focalización basada en CRISPR del potenciador transcripcional BCL11A. El laboratorio de Orkin colaboró con el laboratorio de Feng Zhang para identificar la edición CRISPR óptima del potenciador BCL11A para lograr la producción terapéutica de γ-globina en adultos. Un análisis CRISPR de mosaico agrupado de alta resolución y alto rendimiento identificó los requisitos de la secuencia de ADN del potenciador con una resolución de casi un solo nucleótido. El análisis de la expresión del gen de la β-globina humana en ratones portadores de una mutación potenciadora seleccionada reveló que la selección del potenciador eritroide de BCL11A in vivo da como resultado una alteración específica de la expresión de BCL11A en los eritroides y una represión relajada de la expresión del gen de la γ-globina en adultos[15]. Vertex Pharmaceuticals y CRISPR Therapeutics ejecutaron esta estrategia de manera rápida y exitosa para desarrollar y lograr la aprobación clínica de CASGEVY para el tratamiento de la anemia de células falciformes y la β-talasemia en 2023 y 2024, respectivamente.
Así, en los 50 años de investigación del ADN recombinante desde la fundación de Cell, se han logrado avances extraordinarios en la comprensión de la base molecular de la regulación génica eucariota, lo que proporciona una conexión directa entre Jacob y Monod y la regulación del cambio de hemoglobina humana. Este ejemplo de terapia génica revela la dificultad y la complejidad de la terapia génica por un lado y su extraordinario impacto por el otro. La finalización del Proyecto Genoma Humano, los avances en genética humana, la amplia gama de tecnologías genómicas (CRISPR, multiómica unicelular y espacial), la secuenciación a gran escala de todo el exoma y el genoma, el desarrollo de potentes herramientas computacionales y el establecimiento de modelos animales y de células madre para estudiar la función genética y la causalidad genética están convergiendo en la realización de la medicina de precisión.
Referencias Bibliográficas
1.
Maniatis, T. ∙ Ptashne, M. ∙ Backman, K. …
Recognition sequences of repressor and polymerase in the operators of bacteriophage lambda
Cell. 1975; 5:109-113
Full Text (PDF)PubMedGoogle Scholar
2.
Ptashne, M.
A Genetic Switch
Blackwell Science, 1986
3.
Efstratiadis, A. ∙ Kafatos, F.C. ∙ Maniatis, T.
The primary structure of rabbit β-globin mRNA as determined from cloned DNA
Cell. 1977; 10:571-585
Full Text (PDF)Scopus (284)PubMedGoogle Scholar
4.
Tilghman, S.M. ∙ Tiemeier, D.C. ∙ Polsky, F. …
Cloning specific segments of the mammalian genome: bacteriophage lambda containing mouse globin and surrounding gene sequences
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977; 74:4406-4410
5.
Wensink, P.C. ∙ Finnegan, D.J. ∙ Donelson, J.E. …
A system for mapping DNA sequences in the chromosomes of Drosophila melanogaster
Cell. 1974; 3:315-325
Full Text (PDF)Scopus (303)PubMedGoogle Scholar
6.
Clarke, L. ∙ Carbon, J.
Functional expression of cloned yeast DNA in Escherichia coli: specific complementation of argininosuccinate lyase (argH) mutations
- Mol. Biol. 1978; 120:517-532
7.
Maniatis, T. ∙ Hardison, R.C. ∙ Lacy, E. …
The isolation of structural genes from libraries of eucaryotic DNA
Cell. 1978; 15:687-701
Full Text (PDF)Scopus (0)PubMedGoogle Scholar
8.
Fritsch, E.F. ∙ Lawn, R.M. ∙ Maniatis, T.
Characterisation of deletions which affect the expression of fetal globin genes in man
Nature. 1979; 279:598-603
9.
Maniatis, T. ∙ Fritsch, E.F. ∙ Lauer, J. …
The molecular genetics of human hemoglobins
Annu. Rev. Genet. 1980; 14:145-178
10.
Wigler, M. ∙ Silverstein, S. ∙ Lee, L.S. …
Transfer of purified herpes virus thymidine kinase gene to cultured mouse cells
Cell. 1977; 11:223-232
Full Text (PDF)Scopus (947)PubMedGoogle Scholar
11.
Wigler, M. ∙ Sweet, R. ∙ Sim, G.K. …
Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes
Cell. 1979; 16:777-785
Full Text (PDF)Scopus (973)PubMedGoogle Scholar
12.
Chao, M.V. ∙ Mellon, P. ∙ Charnay, P. …
The regulated expression of beta-globin genes introduced into mouse erythroleukemia cells
Cell. 1983; 32:483-493
Full Text (PDF)PubMedGoogle Scholar
13.
Harris, T.
In Pursuit of Unicorns: Journey through 50 Years of Biotechnology
Cold Spring Harbor Press, 2024
14.
Schaffner, W.
Enhancers, enhancers – from their discovery to today’s universe of transcription enhancers
Biol. Chem. 2015; 396:311-327
Scopus (69)PubMedGoogle Scholar
15.
Zheng, G. ∙ Orkin, S.H.
Transcriptional repressor BCL11A in erythroid cells
Adv. Exp. Med. Biol. 2024; 1459:199-215